[發明專利]抑制雞Sirt1基因表達的microRNA及其重組過表質粒以及LMH細胞系

有效

• 申請號: 201811118711.3
• 申請日: 2018-09-26
• 公開（公告）號: CN109161545B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 郁建鋒;顧志良;王中亮;陳遲遲;張燕萍;邵芳;徐璐;胡悅
• 申請（專利權）人: 常熟理工學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N15/66;C12N5/10;A61K31/7105;A61P1/16;A61P3/04
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 楊曉莉

1.一種microRNA過表逆轉錄病毒載體，其特征在于，其構建方法包括以下步驟：利用pLNHX質粒的基礎序列和fpcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR質粒上的microRNA表達框架序列構建pLNCX-pmiRG質粒，設計引物，采用PCR擴增法分別在pLNCX-pmirG的microRNA表達框添加插入表達gSmiR30前體DNA序列，獲得重組過表的microRNA的質粒：pLNCX-gSmiR30；

所述pLNCX-gSmiR30設計引物為gga-miR-SIRT1-30-F/R，序列如SEQ ID NO:5-6所示；

其中，所述gSmiR30，其序列如SEQ ID NO:1所示，通過克隆雞Sirt1基因的3′UTR序，然后選取堿基序列中的“CAGCATTAGAAGCTTTGGCAT”位點作為靶點設計得到；

PCR反應體系：

反應條件：

2.權利要求1所述microRNA過表逆轉錄病毒載體在制備治療雞Sirt1基因表達異常相關疾病藥物中的應用。

3.一種低表達Sirt1基因的LMH細胞系，其特征在于，利用過表達權利要求1所述microRNA構建，包括以下步驟：挑選權利要求1所述的microRNA進行病毒包裝后，感染LMH細胞系；然后利用G418抗性加壓篩選和綠色熒光蛋白檢測結合的方法篩選獲得Sirt1基因低表達的LMH亞克隆細胞系；所述G418加壓篩選的濃度為1μg/mL，篩選10天后，轉接細胞后繼續加壓篩選，重復3-5次，最終以獲得綠色熒光蛋白表達率在98％以上的細胞為重組細胞。