[發(fā)明專利]嵌合抗原受體、其制備方法、利用其修飾的NK細(xì)胞及治療HBV感染的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811117999.2
• 申請(qǐng)日: 2018-09-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109265559B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉明錄;王立新;韓國(guó)英;金海鋒;張傳鵬;馮建海;韓慶梅;劉敏;王亮;萬(wàn)磊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東興瑞生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K19/00
• 分類(lèi)號(hào): C07K19/00;C12N5/10;C12N15/867;A61K35/17;A61P31/20
• 代理公司: 山東華君知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37300
• 代理人: 張儉偉

本發(fā)明涉及嵌合抗原受體、其制備方法、利用其修飾的NK細(xì)胞及治療HBV感染的應(yīng)用，嵌合抗原受體，包含leader核酸人工序列、HBsAg單鏈抗體核酸人工序列、CD8α鉸鏈區(qū)核酸人工序列、NKG2D跨膜區(qū)核酸人工序列、2B4共刺激區(qū)核酸人工序列、CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)核酸人工序列、T2A自剪切區(qū)核酸人工序列、IFN?α核酸人工序列、RQR8分子開(kāi)關(guān)區(qū)核酸人工序列。本發(fā)明針對(duì)共同“α”決定簇特異性抗體，可以識(shí)別不同亞型中的HBsAg，因此本發(fā)明Anti?HBsAg?IFN?α?CAR NK細(xì)胞對(duì)所有HBV亞型感染都有治療作用，同時(shí)也減少治療劑量和毒副反應(yīng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及嵌合抗原受體、其制備方法、利用其修飾的NK細(xì)胞及治療HBV感染的應(yīng)用。

背景技術(shù)

HBV感染是一個(gè)威脅人類(lèi)健康的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的傳染病。據(jù)估計(jì)，全世界大約有20億人口曾經(jīng)感染過(guò)乙型肝炎病毒，其中慢性HBV感染者達(dá)到了近2.4億至3.5億，其中25％的患者因HBV引起終生感染而導(dǎo)致肝硬化或癌癥。目前公認(rèn)的化學(xué)治療方法包括干擾素-α(Interferon-α，IFN-α)和核苷類(lèi)似物。核苷類(lèi)似物是通過(guò)多功能逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)阻斷病毒DNA的合成。口服核苷酸類(lèi)似物可以有效降低病人體內(nèi)HBV-DNA的水平，但存在停藥后病毒爆發(fā)的危險(xiǎn)。因此病人需要長(zhǎng)期服藥，然而長(zhǎng)期服用核苷酸類(lèi)似物又會(huì)導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生。干擾素能通過(guò)抑制病毒DNA復(fù)制和激活機(jī)體抗病毒免疫來(lái)達(dá)到治療效果。但是在接受干擾素治療的病人中只有不足10％產(chǎn)生持續(xù)的治療作用。并且干擾素的副作用多(比如流感樣癥狀、疲勞和血球計(jì)數(shù)低等)且具有嚴(yán)格的適應(yīng)癥。如何控制和清除HBV 的感染、減緩甚至終止肝硬化的發(fā)展，降低肝癌的發(fā)生率是目前醫(yī)學(xué)界的重大課題。

HBV屬于DNA病毒，基因組長(zhǎng)約3200bp，是一種相當(dāng)小的病毒，為部分雙鏈環(huán)狀DNA，由一條較短的正鏈及一條較長(zhǎng)的負(fù)鏈構(gòu)成，其中負(fù)鏈有四個(gè)開(kāi)放式閱讀框，即S、P、C及X區(qū)，能夠編碼全部的病毒蛋白，包括表面抗原(HBsAg)、核心抗原(HBcAg)、X蛋白和病毒聚合酶在內(nèi)的四種蛋白。目前對(duì)于HBV的分類(lèi)方法有兩種，一是根據(jù)HBsAg表面抗原決定簇的不同，可以將其分為不同亞型，主要包括：adw、adr、ayw和ayr；另一個(gè)則是以據(jù)HBV全基因組序列差異性不小于8％的標(biāo)準(zhǔn)或者S因組序列差異性不小于4.2％的標(biāo)準(zhǔn)，將HBV分為 A-H八類(lèi)。不同HBV基因型的分布具有明確的地域特征，我國(guó)以B型及C型為主，且南方多為C基因型，而北方多為B基因型。

HBV具有嚴(yán)格的種屬特性主要感染人類(lèi)及靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。其感染宿主肝細(xì)胞及增殖過(guò)程大致如下；HBV可以附著到細(xì)胞表面并結(jié)合進(jìn)入鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽受體。期間或即刻啟動(dòng)進(jìn)入程序，首先脫去包膜蛋白(即乙肝表面抗原HBsAg)，后脫去包膜的病毒衣殼進(jìn)入肝細(xì)胞，衣殼中含有HBV松弛狀的雙鏈DNA(Relaxed circular DNA，rcDNA)，然后rcDNA被運(yùn)輸至細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)rcDNA一部分整合到基因組上，另一部分可以轉(zhuǎn)化成共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋DNA分子即cccDNA，其過(guò)程是DNA聚合酶將具有缺口的rcDNA的兩條鏈補(bǔ)齊，形成cccDNA。然后cccDNA作為模板，利用宿主RNA聚合II，轉(zhuǎn)錄生成mRNA，其中長(zhǎng)度為3.5kb的mRNA攜帶HBV DNA序列的所有上遺傳信息，稱為前基因組RNA(Pregenomic RNA，pgRNA)。pgRNA出細(xì)胞核同P區(qū)編碼的聚合酶結(jié)合，后被核心蛋白包裹，到此核衣殼形成。然后在HBV聚合酶的作用下，以pgRNA為模板，合成負(fù)鏈DNA，然后再以負(fù)鏈為模板合成正鏈DNA，由此產(chǎn)生了子代的部分雙鏈環(huán)狀DNA，最后到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)行包膜，形成完整的HBV 被釋放至肝細(xì)胞外。肝細(xì)胞質(zhì)中的子代部分雙鏈環(huán)狀DNA也可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，再形成cccDNA并繼續(xù)復(fù)制。

由于HBV病毒亞型眾多，目前的嵌合抗原受體及細(xì)胞無(wú)法對(duì)不同的亞型識(shí)別，導(dǎo)致治療的范圍比較局限。

因此，開(kāi)發(fā)新的嵌合抗原受體、其制備方法、利用其修飾的NK細(xì)胞及治療HBV感染的應(yīng)用，不但具有迫切的研究?jī)r(jià)值，也具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和工業(yè)應(yīng)用潛力，這正是本發(fā)明得以完成的動(dòng)力所在和基礎(chǔ)。