[發明專利]嵌合抗原受體、其制備方法、利用其修飾的NK細胞及治療HBV感染的應用

有效

• 申請號: 201811117999.2
• 申請日: 2018-09-25
• 公開（公告）號: CN109265559B
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 劉明錄;王立新;韓國英;金海鋒;張傳鵬;馮建海;韓慶梅;劉敏;王亮;萬磊
• 申請（專利權）人: 山東興瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N5/10;C12N15/867;A61K35/17;A61P31/20
• 代理公司: 山東華君知識產權代理有限公司 37300
• 代理人: 張儉偉

1.嵌合抗原受體，其特征在于：包含leader核酸人工序列、HBsAg單鏈抗體核酸人工序列、CD8α鉸鏈區核酸人工序列、NKG2D跨膜區核酸人工序列、2B4共刺激區核酸人工序列、CD3ζ信號傳導區核酸人工序列、T2A自剪切區核酸人工序列、IFN-α核酸人工序列、RQR8分子開關區核酸人工序列；

其中，具體地，所述嵌合抗原受體包含依序連接的

如SEQ ID NO.2所述的leader核酸人工序列；

如SEQ ID NO.3所述HBsAg單鏈抗體核酸人工序列；

如SEQ ID NO.4所述CD8α鉸鏈區核酸人工序列；

如SEQ ID NO.5所述NKG2D跨膜區核酸人工序列；

如SEQ ID NO.6所述2B4共刺激區核酸人工序列；

如SEQ ID NO.7所述CD3ζ信號傳導區核酸人工序列；

如SEQ ID NO.8所述T2A自剪切區核酸人工序列；

如SEQ ID NO.9所述IFN-α核酸人工序列；

如SEQ ID NO.8所述T2A自剪切區核酸人工序列；

如SEQ ID NO.10所述RQR8分子開關區核酸人工序列。

2.如權利要求1所述的嵌合抗原受體，其特征在于：所述嵌合抗原受體的核酸序列如SEQ ID NO.1所述。

3.如權利要求1所述的嵌合抗原受體的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）分別按leader核酸人工序列、HBsAg單鏈抗體核酸人工序列、CD8α鉸鏈區核酸人工序列、NKG2D跨膜區核酸人工序列、2B4共刺激區核酸人工序列、CD3ζ信號傳導區核酸人工序列、T2A自剪切區核酸人工序列、IFN-α核酸人工序列、T2A自剪切區核酸人工序列、RQR8分子開關區核酸人工序列合成其整個表達框并插入標準載體pUC上，得到pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR；

（2）將pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR進行雙酶切，利用瓊膠電泳將Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段瓊膠部位切下，利用DNA extraction kit溶膠液處理、過DF柱棄濾液、漂洗DF柱、空離、洗脫DF柱、收集離心物，得到純化的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段，即為嵌合抗原受體。

4.NK細胞，其特征在于：該NK細胞含有如權利要求1或2所述的嵌合抗原受體。

5.如權利要求4所述的NK細胞，其特征在于：所述NK細胞采用包括如下步驟的方法制備得到：首先將pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR質粒進行慢病毒包裝，然后利用重組慢病毒感染免疫細胞。

6.如權利要求5所述的NK細胞，其特征在于：所述pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR質粒是將融合基因片段Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA插入慢病毒表達載體pLent-C-GFP得到的pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR質粒。

7.如權利要求6所述的NK細胞，其特征在于：所述pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR 質粒采用包括如下步驟的制備方法得到：將純化的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段和線性化的pLent-C-GFP DNA片段在16℃進行過夜連接形成pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR質粒；連接體系為：10×buffer：1μl；T4連接酶：1μl；Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA：4μl；線性化的pLent-C-GFP DNA：4μl。

8.如權利要求1所述的嵌合抗原受體在制備治療HBV感染方面的藥物中的應用。