[發明專利]一種廣地龍的環介導等溫擴增檢測引物及基于LAMP技術鑒定廣地龍的方法

有效

• 申請號: 201811115439.3
• 申請日: 2018-09-25
• 公開（公告）號: CN109182536B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 黃慶;毛潤乾;李志武
• 申請（專利權）人: 廣東省科學院動物研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 胡素麗;劉明星

本發明公開了一種廣地龍的環介導等溫擴增檢測引物及基于LAMP技術鑒定廣地龍的方法。本發明針對廣地龍的COⅠ基因，設計和篩選了一套特異性檢測引物以及含有該檢測引物的檢測試劑盒和利用該檢測試劑盒通過環介導等溫擴增進而確定待測樣品是否為廣地龍的鑒定方法。本發明操作簡單，結果檢測只需肉眼觀察，不需要昂貴的檢測儀器，靈敏度比常規PCR高1000倍。本發明所需成本低，可應用于地龍商品的真偽鑒定。

技術領域：

本發明屬于中藥材資源鑒定技術領域，具體涉及一種廣地龍的環介導等溫擴增檢測引物及基于LAMP技術鑒定廣地龍的方法。

背景技術：

廣地龍是環節動物門鉅蚓科動物，是中國傳統的動物中藥材，其用藥歷史悠久，廣地龍和廣地龍類制劑在臨床應用廣泛。廣地龍有多種藥理作用，主要包括降壓、平喘、解熱抗炎、抗血栓、抗腫瘤等。地龍是中國民間傳統用藥，根據中國藥典記載，地龍包括廣地龍和滬地龍，其中廣地龍的質量被認為行業品質最優。中國的品種較多，形態大小因品種差異而不同，加工成中藥材后，增加了品種的辨別難度。經調查，中藥材市場上地龍商品偽品較多，嚴重影響了中藥材用藥的穩定性和安全性，需要一種新的鑒定技術，快速完成地龍商品的鑒定。

等溫環介導擴增技術(LAMP)是一種新的核酸擴增技術，反應可在恒溫(60-65℃)條件30-60min內完成擴增。反應結束后，在反應液中加入熒光染料SYBR Green I，通過肉眼觀察顏色變化即可判斷結果。相比常規PCR技術，LAMP反應操作簡單，耗時短，不需要昂貴的儀器設備，反應靈敏度高等有點。近幾年，LAMP技術逐漸用于中藥材鑒定和肉制品鑒定中，包括人參、冬蟲夏草、木通、牛肉、豬肉等。但有關利用LAMP技術鑒定蚯蚓品種未見有報道。本發明利用LAMP鑒定技術應用于中藥市場的廣地龍商品鑒定中，減少市場偽品的混入，為中藥材質量提供保障。

發明內容：

本發明的目的是提供一種靈敏度高、特異性強、檢測時間短、對儀器設備要求低的廣地龍的環介導等溫擴增檢測引物及基于LAMP技術鑒定廣地龍的方法。

本發明的第一個目的是提供一種廣地龍的環介導等溫擴增檢測引物，所述的檢測引物如下所示：

上游內引物FIP：5’-CAACAGCCGCAGACCTTACTATTTTAACATAAGATTTTGACTTTTGCC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

下游內引物BIP：5’-GGACAGTTTACCCCCCTTTAGCTTTTGCTAAATGTAGTGAGAAAATTGCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

上游外引物F3：5’-CATAGCATTCCCACGTCTA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

下游外引物B3：5’-ACCTAAAATTGATGAGGCAC-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

本發明的第二個目的是提供一種廣地龍的環介導等溫擴增檢測試劑盒，包括環介導等溫擴增反應液、Bst DNA聚合酶、陽性對照質控品、陰性對照質控品和檢測引物，所述的檢測引物包括：

上游內引物FIP：5’-CAACAGCCGCAGACCTTACTATTTTAACATAAGATTTTGACTTTTGCC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

下游內引物BIP：5’-GGACAGTTTACCCCCCTTTAGCTTTTGCTAAATGTAGTGAGAAAATTGCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

上游外引物F3：5’-CATAGCATTCCCACGTCTA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

下游外引物B3：5’-ACCTAAAATTGATGAGGCAC-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

所述的陽性對照質控品優選為含有廣地龍的COⅠ基因(如SEQ ID NO.5所示)的質粒DNA。