[發明專利]一種廣地龍的環介導等溫擴增檢測引物及基于LAMP技術鑒定廣地龍的方法

有效

• 申請號: 201811115439.3
• 申請日: 2018-09-25
• 公開（公告）號: CN109182536B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 黃慶;毛潤乾;李志武
• 申請（專利權）人: 廣東省科學院動物研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 胡素麗;劉明星

1.一種廣地龍的環介導等溫擴增檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

上游內引物FIP：5’-CAACAGCCGCAGACCTTACTATTTTAACATAAGATTTTGACTTTTGCC-3’；

下游內引物BIP：5’-GGACAGTTTACCCCCCTTTAGCTTTTGCTAAATGTAGTGAGAAAATTGCA-3’；

上游外引物F3：5’-CATAGCATTCCCACGTCTA-3’；

下游外引物B3：5’-ACCTAAAATTGATGAGGCAC-3’。

2.一種廣地龍的環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，包括環介導等溫擴增反應液、Bst DNA聚合酶、陽性對照質控品、陰性對照質控品和檢測引物，所述的檢測引物如下所示：

上游內引物FIP：5’-CAACAGCCGCAGACCTTACTATTTTAACATAAGATTTTGACTTTTGCC-3’；

下游內引物BIP：5’-GGACAGTTTACCCCCCTTTAGCTTTTGCTAAATGTAGTGAGAAAATTGCA-3’；

上游外引物F3：5’-CATAGCATTCCCACGTCTA-3’；

下游外引物B3：5’-ACCTAAAATTGATGAGGCAC-3’。

3.根據權利要求2所述的廣地龍的環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照質控品為含有廣地龍的COⅠ基因的質粒DNA。

4.根據權利要求2所述的廣地龍的環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的陰性對照質控品為ddH₂O。

5.一種基于LAMP技術鑒定廣地龍的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）提取待測樣品的基因組DNA作為模板；

（2）使用權利要求1所述的廣地龍的環介導等溫擴增檢測引物，與環介導等溫擴增反應液、Bst DNA聚合酶和待測樣品的基因組DNA混合形成LAMP反應體系，進行環介導等溫擴增反應，以陽性對照質控品和陰性對照質控品分別作為陽性對照和陰性對照；

（3）擴增反應完成后，通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷待測樣品LAMP反應體系中是否擴增得到擴增產物，來判斷待測樣品是否為廣地龍；

通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷待測樣品LAMP反應體系中是否擴增得到擴增產物，來判斷待測樣品是否為廣地龍具體為通過瓊脂糖凝膠電泳法或SYBR Green I熒光染色顯色法同時檢測陽性對照、陰性對照和待測樣品LAMP反應體系的擴增產物，根據是否有梯形條帶或反應體系的顏色來判斷待測樣品是否為廣地龍；

所述步驟（2）的LAMP反應體系總體積為25 μL：包括DNA模板1 μL，10 pmol/μL的FIP和BIP各4 μL，10 pmol/μL的F3和B3各0.5 μL，10×Bst DNA聚合酶緩沖液2.5 μL，10 mMdNTPs 3.5 μL、100 mM MgSO₄ 1.5 μL、ddH₂O 6.5 μL和8 U/mL Bst DNA聚合酶1 μL；所述步驟（2）的進行環介導等溫擴增反應，其反應參數為：將LAMP反應體系中除Bst DNA聚合酶以外的其他組分混合，置于95℃水浴鍋中水浴5 min，迅速放在冰上冷卻，加入Bst DNA聚合酶，61-64℃恒溫反應50-60 min，80℃孵育10 min；

所述的陽性對照質控品為含有廣地龍的COⅠ基因的質粒DNA；

所述的陰性對照質控品為ddH₂O。