[發(fā)明專利]空間鄰近化學發(fā)光法檢測腫瘤壞死因子的試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811115053.2
• 申請日: 2018-09-25
• 公開（公告）號: CN109142334A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發(fā)明（設計）人: 奚偉紅;廖鴛鴦;朱丹丹
• 申請（專利權）人: 無錫壹閃生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N33/577;G01N33/535
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司 11514
• 代理人: 向霞

1.一種腫瘤壞死因子-α的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

酶標記物、發(fā)光標記物、輔助劑、觸發(fā)劑和校準品；

其中，所述酶標記物的原料組分包括過氧化物酶標記的TNF-α檢測抗體，所述發(fā)光標記物的原料組分包括9,10-二氫吖啶標記的TNF-α捕獲抗體。

2.根據(jù)權利要求1所述的腫瘤壞死因子-α的檢測試劑盒，其特征在于：

所述酶標記物的原料組分還包括0.05M磷酸鹽緩沖液；

優(yōu)選地，制備方法包括：

稱取5mg HRP溶解于1mL蒸餾水中，之后加入0.2mL新配的0.1M過碘酸鈉溶液，室溫下避光攪拌20min，將上述溶液裝入透析袋中，對1mM pH 4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜；

加入20μL 0.2M pH 9.5碳酸鹽緩沖液，然后立即加入1mg抗TNF-α單克隆抗體室溫避光輕輕攪拌2h，加新配的4mg/mL硼氫化鈉液，混勻，于4℃放置2h，將上述液裝入透析袋中，對0.15M pH 7.4PBS透析，4℃過夜；

取出透析物，加適量甘油后置于-20℃冰箱保存。

3.根據(jù)權利要求1所述的腫瘤壞死因子-α的檢測試劑盒，其特征在于：

所述發(fā)光標記物的原料組分還包括0.05M Tris緩沖液；

優(yōu)選地，制備方法包括：

將發(fā)光底物Acridan用500μL的DMF溶解；

吸取溶解的Acridan 41.3μL，加入0.05M硼酸鈉緩沖液708.7μL，再加入250μL抗TNF-α單克隆抗體，翻轉混勻4～5次，室溫靜置30min；

將標記反應管置于搖床上，于2～8℃下混合過夜，取出加入適量甘油后置于-20℃冰箱保存。

4.根據(jù)權利要求1所述的腫瘤壞死因子-α的檢測試劑盒，其特征在于：

所述輔助劑的組分包括發(fā)光輔助劑和pH 6.0的枸櫞酸鹽緩沖液；

優(yōu)選地，制備方法包括：

稱取枸櫞酸1.82g，枸櫞酸鈉10.45g，加純水溶解并定容至1000mL，在枸櫞酸鹽緩沖液中加入發(fā)光輔助劑，混勻后分裝，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫黄渲校鼉?yōu)選每瓶裝10mL。

5.根據(jù)權利要求1所述的腫瘤壞死因子-α的檢測試劑盒，其特征在于：

所述觸發(fā)劑選用0.05M pH 8.0Tris-HCl緩沖液；

優(yōu)選地，制備方法包括：

稱取Tris 6.06g，氯化鈉9g，加適量純水溶解，再加入濃HCl 2.1mL混勻；之后加入吐溫-20 2mL，混勻后定容至1000mL，分裝，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫黄渲校鼉?yōu)選每瓶裝200mL。

6.根據(jù)權利要求1所述的腫瘤壞死因子-α的檢測試劑盒，其特征在于：

所述校準品包括不同濃度TNF-α抗原的校準品和0.1M校準品稀釋液；

優(yōu)選地，制備方法包括：

配制校準品稀釋液：稱取磷酸二氫鉀14.1g，NaH₂PO₄·2H₂O 3.0g，加超純水溶解，Proclin-300 0.5～1mL，混勻后，加超純水定容至1000mL，得到校準品稀釋液，2～8℃儲存?zhèn)溆茫?/p>

配制校準品：校準品的濃度為0、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL，用所述校準品稀釋液將純化TNF-α稀釋至相應濃度，2～8℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

7.權利要求1～6任一項所述的檢測試劑盒在空間鄰近化學發(fā)光法檢測腫瘤壞死因子-α中的應用。

8.權利要求1～6任一項所述的試劑盒在空間鄰近化學發(fā)光法檢測腫瘤壞死因子-α時的方法，包括步驟：

S1：分別加入25μL標準品、25μL過氧化物酶標記的TNF-α檢測抗體和25μL發(fā)光標記物至化學發(fā)光反應管；

S2：于37℃恒溫箱反應15min；

S3：分別加入5μL輔助劑至化學發(fā)光反應管，震蕩混勻，靜置1～2min；之后分別加入觸發(fā)劑75μL，震蕩混勻，立即檢測，讀取信號值；

S4：對校準品的濃度和發(fā)光值進行l(wèi)ogistic四參數(shù)擬合，通過樣本發(fā)光值計算樣本濃度。