[發明專利]一種具有免疫原性的重組PRRSV病毒樣顆粒及其制備

有效

• 申請號: 201811114020.6
• 申請日: 2018-09-25
• 公開（公告）號: CN109385435B
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 陳瑞;杜恩岐;董劍輝;張滿義
• 申請（專利權）人: 陜西諾威利華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C07K14/08;C12N15/866;C12N7/01;A61K39/12;A61P31/14
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本發明公開了一種重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)病毒樣顆粒(VLP)及其制備方法與應用。基于對PRRSV流行毒株的GP5與M基因序列的比對分析,人工合成GP5與M串聯序列GP5M,以pBAC5質粒為骨架，將合成的GP5M基因序列克隆入該載體,得到桿狀病毒轉移載體pBAC?PRRSVGP5M,進而得到重組桿粒rBacmid?GP5M,將桿粒轉染sf9細胞,獲得重組桿狀病毒Ac?PRRSVGP5M。重組桿狀病毒高效表達PRRSV的GP5與M蛋白并形成病毒樣顆粒。本發明的重組桿狀病毒所表達的蛋白制備亞單位疫苗,免疫動物后可誘導機體產生特異性免疫反應,并能保護豬體對抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒強毒的攻擊。

技術領域

本發明屬于農業獸用生物技術領域，具體涉及一種具有免疫原性的重組PRRSV病毒樣顆粒及其制備與應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) 是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的一種高度傳染性疾病，因其臨床上常常造成耳部發紺，又稱藍耳病，，主要引起母豬早產、流產、產死胎或木乃伊胎，仔豬和育成豬出現呼吸道疾病，發病率與死亡率高。該病最初于20世紀80年代在美國被首先報道，1996年起在我國發現首例臨床病毒分離報道，2005年底出現高致病性PRRSV的大面積爆發。PRRSV是呈單股正鏈的RNA 病毒，屬于動脈炎病毒科，根據抗原性和基因序列的不同，將全球的PRRSV 分為以 VR-2332 為代表的美洲型(North American，NA)和以Lelystad virus (LV)為代表的歐洲型(European，EU)。我國流行的PRRSV 主要是經典美洲株和變異型美洲株，但近幾年歐洲株也屢有發現。此外，PRRSV 變異性和重組能力強，不時有新分支出現，比如最近報道的NADC30-Like亞型與GM2亞型呈現流行趨勢逐漸上升的態勢。PRRS 對全球養豬業都是巨大的威脅，2005年PRRS對美國生豬養殖造成的經濟損失是5.6億美元，其中母豬繁殖階段損失6700萬美元，斷奶仔豬是2.01億美元，而生長育肥豬損失最多，達到了2.92億美元。2013年，Holtkampra估算PRRS對美國生豬養殖造成的經濟損失達到了6.63億美元，這比2005年高出了10%。歐洲2012年的數據顯示PRRS導致的經濟損失是126歐元/頭，，這比2005年美國的數據(121美元/頭)還要高。

PRRSV是單股正鏈、不分節段、有囊膜的RNA 病毒，病毒粒子大小約為50-70 納米（nanometer，nm），基因組全長為14.9-15.5 kb，含有至少10 個開放閱讀框（open readingframe，ORF）。ORF1a 區域編碼非結構蛋白（non-structural protein， NSP）NSP1α/β 至NSP8，ORF1b 區域則編碼NSP9至NSP12； ORF2a、ORF2b 和ORFs3-7，編碼與病毒粒子結合的結構蛋白（Structural protein，SP）GP2、E、GP3、GP4、ORF5a、GP5、M與N，它們是由巢式3’共末端的一系列亞基因組mRNAs 翻譯而來的；在10個ORFs兩側分別是5’端非編碼區和3’端非編碼區。PRRSV的結構蛋白包含GP5-M二聚體蛋白、GP2-GP3-GP4復合體蛋白和具有疏水性的E蛋白與ORF5a蛋白，它們與病毒的侵入及出芽密切相關。GP5蛋白（含大約200個氨基酸）是PRRSV中具有高變異特性的結構蛋白，其與M蛋白（含大約175個氨基酸）通過二硫鍵結合形成的GP5-M二聚體蛋白可與宿主細胞的唾液酸粘附素受體結合而使病毒吸附到宿主細胞表面，而病毒的內化步驟也與GP5密切相關，最近研究發現宿主細胞中如果存在大量表達的GP5蛋白時，可介導產生β干擾素以抑制PRRSV的增殖；已有研究報道GP5與M可形成病毒樣顆粒，病毒樣顆粒(virus-like particles， VLPs)是某種病毒的一個或多個結構蛋白裝配成的空心顆粒，它既有類似天然病毒的穩定性和免疫原性，又具備攜帶外源蛋白或多肽的潛能，不含有病毒的核酸，沒有感染性，使其 有望成為構建多價疫苗的良好載體。