[發明專利]一種具有免疫原性的重組PRRSV病毒樣顆粒及其制備

有效

• 申請號: 201811114020.6
• 申請日: 2018-09-25
• 公開（公告）號: CN109385435B
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 陳瑞;杜恩岐;董劍輝;張滿義
• 申請（專利權）人: 陜西諾威利華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C07K14/08;C12N15/866;C12N7/01;A61K39/12;A61P31/14
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1.一種人工修飾合成的豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV GP5-M基因，其序列如SEQ IDNO.1所示，編碼的蛋白質為SEQ ID NO.4所示。

2.一種桿狀病毒轉移載體pBAC-PRRSVGP5-M，載體含有權利要求1所述的人工修飾合成的豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV GP5-M基因和標記基因GFP。

3.一種表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV GP5與M蛋白的重組桿狀病毒，毒株被命名為重組桿狀病毒Ac-PRRSVGP5-M，所述桿狀病毒由權利要求2所述的轉移載體制備得到。

4.一種表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV GP5與M蛋白的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，表達PRRSV GP5與M蛋白的重組桿狀病毒的構建，通過下述步驟制備獲得：

（1）PRRSV的免疫原性基因GP5與M的串聯基因GP5-M的人工修飾合成，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示；

（2）桿狀病毒轉移載體的構建：以pBAC5質粒為骨架，通過Xba I與BamH I酶切載體與插入片段，然后通過T4連接酶于16℃過夜連接，轉化篩選陽性克隆，提取重組質粒，酶切鑒定，獲得桿狀病毒轉移載體pBAC-PRRSV GP5-M；

步驟二，重組桿狀病毒Ac-PRRSV GP5-M的構建：

（1）重組桿粒rBac-PRRSVGP5-M的獲得與鑒定：取測序鑒定正確的桿狀病毒轉移載體pBAC-PRRSVGP5-M質粒DNA與DH10 Bac感受態細胞混合，冰浴30分鐘后，于42℃進行45秒水浴熱激，然后冰浴5分鐘，加入SOC液體培養基，37℃振蕩培養2小時，按10倍系列稀釋之后，各梯度菌液涂布LB平板，使用life公司的篩選試劑盒篩選純化陽性菌落，提取重組桿粒rBac-PRRSVGP5-M；

（2）重組桿狀病毒Ac-PRRSVGP5-M的獲得：將上一步提取的重組桿粒rBac-PRRSVGP5-M，使用脂質體轉染試劑Lipofectamine3000，轉染至sf9細胞中，在28℃持續培養觀察，于轉染后24小時、48小時與72小時利用熒光顯微鏡觀察重組桿狀病毒綠色熒光信號，并于轉染后72小時收集細胞上清，得到重組桿狀病毒，然后將其再次接種健康sf9細胞擴大培養，收集病毒液作為毒種置于-70℃保存備用。

5.權利要求4中所述的表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV GP5與M蛋白的重組桿狀病毒在制備亞單位疫苗中的應用，所述亞單位疫苗包括PRRSV病毒樣顆粒和佐劑，所述PRRSV病毒樣顆粒由權利要求4中所述的表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV GP5與M蛋白的重組桿狀病毒接種健康sf9細胞后表達得到。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述佐劑為Seppic ISA 206佐劑。

7.一種重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒病毒樣顆粒疫苗，其特征在于，由PRRSV病毒樣顆粒和佐劑組成，所述PRRSV病毒樣顆粒由權利要求4中所述的表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV GP5與M蛋白的重組桿狀病毒接種健康sf9細胞后表達得到。

8.根據權利要求7所述的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒病毒樣顆粒疫苗的制備方法，其特征在于，將權利要求4制備得到的重組桿狀病毒Ac-PRRSVGP5-M按10%比例接種健康sf9細胞，27℃培養4-5天后，反復凍融收集細胞及上清，于4℃條件下12000r/min離心20分鐘后收集上清，然后使用硫酸銨沉淀法將目的蛋白沉淀，重懸后使用二乙烯亞胺對蛋白溶液進行36-48小時滅活，之后使用等量硫代硫酸鈉中和，最后與Seppic ISA 206佐劑混合乳化配制疫苗，置于2-8℃備用。