[發(fā)明專利]一種提高外源蛋白表達(dá)量的蛋白合成體系及其應(yīng)用方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811113130.0
• 申請(qǐng)日: 2018-09-25
• 公開（公告）號(hào): CN110938649A
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭敏;丁曉輝;劉顯成;楊寧;王紹杰;董穎穎;王靜;代田純;于雪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 康碼（上海）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N15/67
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供了一種提高外源蛋白表達(dá)量的蛋白合成體系及其應(yīng)用方法，具體地，通過在編碼eIF4E結(jié)合蛋白的核苷酸序列前插入強(qiáng)啟動(dòng)子序列構(gòu)建的多核苷酸序列或載體，實(shí)現(xiàn)對(duì)Eap1p、p20等eIF4E結(jié)合蛋白過表達(dá)，并利用含有該改造的細(xì)胞裂解液進(jìn)行外源蛋白合成。本發(fā)明提供了提高外源蛋白表達(dá)量的蛋白合成體系，本發(fā)明的合成體系可顯著提高蛋白質(zhì)翻譯的效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種提高外源蛋白表達(dá)量的蛋白合成體系及其應(yīng)用方法。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)是細(xì)胞中的重要分子，幾乎參與了細(xì)胞所有功能的執(zhí)行。蛋白的序列和結(jié)構(gòu)不同，決定了其功能的不同。在細(xì)胞內(nèi)，蛋白可以作為酶類催化各種生化反應(yīng)，可以作為信號(hào)分子協(xié)調(diào)生物體的各種活動(dòng)，可以支持生物形態(tài)，儲(chǔ)存能量，運(yùn)輸分子，并使生物體運(yùn)動(dòng)。在細(xì)胞中，蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)節(jié)在應(yīng)對(duì)營養(yǎng)缺失等外界壓力，細(xì)胞發(fā)育與分化等很多過程中發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)翻譯的四個(gè)過程包括翻譯起始、翻譯延伸、翻譯終止和核糖體再循環(huán)，其中受調(diào)控最多和限速的步驟是翻譯的起始[1]。真核細(xì)胞的翻譯起始可以分為兩大類：“帽子結(jié)構(gòu)”依賴的傳統(tǒng)途徑和“帽子結(jié)構(gòu)”非依賴的途徑。

在細(xì)菌的翻譯起始過程中，30S小亞基在3種起始因子的介導(dǎo)下直接在起始密碼子的AUG附近形成起始復(fù)合體。真核生物的翻譯起始則較為復(fù)雜，需要11種起始因子，并且核糖體在起始蛋白質(zhì)合成時(shí)與mRNA結(jié)合的位點(diǎn)與原核生物不同[2]。真核生物的具有“帽子結(jié)構(gòu)”(cap structure,m7GpppN)的mRNA翻譯起始主要是通過依賴“帽子結(jié)構(gòu)”的掃描機(jī)制進(jìn)行的[1-3]。直接與帽子發(fā)生相互作用的是eIF4F，由eIF4G蛋白同時(shí)結(jié)合RNA解旋酶eIF4A和eIF4E而組成的翻譯因子起始復(fù)合物。其中的eIF4E是帽子結(jié)合蛋白，為真核生物蛋白質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，與eIF4E發(fā)生相互作用的蛋白4E-BPs(eIF4E-binding proteins)，通過結(jié)合eIF4E，使其不能和eIF4G結(jié)合，從而不能形成翻譯起始復(fù)合物eIF4F，抑制依賴帽子結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯[4]。人源4E-BP1蛋白是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的底物之一，磷酸化水平受到mTOR信號(hào)通路的調(diào)控。當(dāng)Thr37，Thr46和Ser65，Thr70殘基被mTORC1先后磷酸化以后，4E-BP1將從eIF4E上解離，從而促進(jìn)eIF4F起始復(fù)合物的形成和依賴帽子結(jié)構(gòu)的翻譯起始[5-6]。mTOR信號(hào)通路影響真核細(xì)胞中翻譯起始及蛋白質(zhì)合成，在細(xì)胞生長增殖過程中起重要作用。

mTOR是一類與細(xì)胞增殖緊密相關(guān)的絲/蘇氨酸蛋白激酶,在進(jìn)化上十分保守，從酵母到哺乳動(dòng)物廣泛存在，對(duì)細(xì)胞外包括生長因子，胰島素，營養(yǎng)素，氨基酸，葡萄糖等多種刺激產(chǎn)生應(yīng)答[7]。人類的編碼TOR蛋白的基因和酵母中的同源性高達(dá)40％-60％[8]。在酵母體內(nèi)沒有和哺乳動(dòng)物4E-BPs在結(jié)構(gòu)上類似的蛋白，在功能上具有類似的結(jié)合eIF4E的蛋白有p20和EAP1p。這兩種蛋白有一段高度相似的13個(gè)殘基序列，其中包含了eIF4E的結(jié)合域YxxxxLΦ,x為任意氨基酸殘基，Φ為疏水殘基。除了這一段序列，這兩種蛋白沒有其他相似的地方，可能EAP1p還具有其他的功能會(huì)進(jìn)一步影響TOR信號(hào)通路的下游[9]。對(duì)于其他真核生物的eIF4E結(jié)合蛋白，人源的4E-BP1、4E-BP2、鼠源的PHAS-I的蛋白序列都已有文獻(xiàn)報(bào)道[10]。

制備的酵母裂解液中含有大量的蛋白質(zhì)合成翻譯機(jī)器，可以通過外源添加模板而合成目標(biāo)蛋白。但是酵母原來的mRNA也會(huì)繼續(xù)使用資源合成非目標(biāo)雜蛋白，影響目標(biāo)蛋白的合成效率和產(chǎn)量。本發(fā)明通過過表達(dá)Eap1p，與eIF4G競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合eIF4E,減少翻譯起始復(fù)合物eIF4F的形成，在體外抑制酵母裂解液中原來的mRNA帽子依賴的翻譯過程，使更多的資源(如其他翻譯因子，核糖體和氨基酸等)用于合成外源添加的不依賴帽子結(jié)構(gòu)的體外蛋白合成體系模板，從而顯著提高體外合成蛋白質(zhì)的效率和產(chǎn)量。

然而，本領(lǐng)域目前的體外生物合成系統(tǒng)的蛋白翻譯合成的效率還較低，難以令人滿意，因此，本領(lǐng)域亟需開發(fā)一種新的可提高外源蛋白翻譯合成效率的體系和方法。