[發明專利]通過多條sgRNA共注射實現同一基因有效敲除

有效

• 申請號: 201811113109.0
• 申請日: 2018-09-25
• 公開（公告）號: CN109234316B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 黃行許;王新;賈堃
• 申請（專利權）人: 肇慶華夏凱奇生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/89;C12N9/22
• 代理公司: 北京迎碩知識產權代理事務所(普通合伙) 11512
• 代理人: 張群峰;錢揚保

通過多條sgRNA共注射實現同一基因有效敲除。敲除方法包括：選定待敲除基因的編碼區的至少兩個目標序列，使其分別包含完整的目標密碼子CAA、CAG或CGA；利用至少兩個sgRNA序列來將BE3定位到相應的目標序列以使目標密碼子中的目標單堿基C變成T從而相應引入終止密碼子TAA或TAG、TGA以實現基因敲除；所述至少兩個sgRNA序列為分別與所述至少兩個目標序列互補對應的序列，其中所述至少兩個sgRNA被共注射以實現同一基因的有效敲除。本發明提供了一種更高效，且具有高精確性和低脫靶效應的基因敲除方法。

技術領域

本發明涉及基于堿基編輯的基因敲除方法策略的改進及其應用。

背景技術

基因編輯技術指對目標基因進行“編輯”，將期望的變化引入基因組DNA的靶位點的過程。早期的基因編輯是通過發現內源性同源重組來實現的。然而，傳統的真核生物靶向基因操作具有基因打靶效率低，應用范圍有限等缺點。II型CRISPR/Cas9(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated Cas9 endonuclease)系統的發現與應用打破了原有限制，該系統被證明是一種多用途基因編輯的工具[Le etal.,2013；Patrick et al.,2014]。

CRISPR/Cas9系統介導特異性基因敲除(knockout)是利用sgRNA(single guidedRNA)通過靶序列互補引導Cas9蛋白定位剪切雙鏈DNA，發生非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)修復，造成移碼突變(frameshift mutation)，導致基因敲除，該方法在實際應用上主要有以下缺點：首先非同源性末端接合機制容易產生隨機插入和刪除(indel)，使得在斷裂點附近可能隨機引入新的堿基，從而導致不精確的基因編輯。其次，CRISPR/Cas9介導的基因編輯總有一些脫靶效應[Gorski et al.,2017]。

最新研究表明，基于CRISPR/Cas9技術所構建的Cas9和脫氨酶的融合蛋白可作為“堿基編輯器(Base editor，BE)”。第一代堿基編輯(BE1)是通過將大鼠胞苷脫氨酶ApOBEC1融合到dCas9,它通過脫氨基作用將C/G堿基對改變為 A/T。此后為提高其編輯效率對BE系統進行了各種修改，目前應用較為廣泛的 BE3可以在sgRNA的非結合鏈的位置4-8堿基的窗口中引入C-T核苷酸替換 [Komor et al.,2016]。這為實現基因敲除提供了新的思路——通過CT突變引入終止密碼子，例如將CAA、CAG、CGA突變成終止密碼子TAA、TAG、TGA，或通過GA突變將TGG突變成終止密碼子TAA、TGA、TAG，終止編碼基因的翻譯，從而實現基因敲除。它提供了比Cas9介導的NHEJ更安全和更精確的敲除策略[Komor et al.,2017；Kim et al.,2017]。然而由于受到BE3編輯效率等因素的限制目前并沒有通過該方法獲得基因有效敲除的實例。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種高效精準的基因敲除策略。

根據本發明的第一方面，提供了一種基因敲除方法，其包括：

選定待敲除基因的編碼區的至少兩個19～21bp-NGG目標序列，使其分別包含完整的目標密碼子CAA、CAG或CGA，其中的目標單堿基C位于目標序列的第4-8位，目標密碼子與NGG間隔12-14bp；

利用至少兩個sgRNA序列來將BE3定位到相應的目標序列以使目標密碼子中的目標單堿基C變成T從而相應引入終止密碼子TAA或TAG、TGA以實現基因敲除；

所述至少兩個sgRNA序列為分別與所述至少兩個目標序列互補對應的 19～21bp序列，

其中所述至少兩個sgRNA被共注射以實現同一基因的有效敲除。