[發(fā)明專利]抗Claudin18A2嵌合抗原受體、其修飾的T細(xì)胞及T細(xì)胞制備方法和用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811112136.6
• 申請日: 2018-09-25
• 公開（公告）號: CN109206524B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉明錄;王立新;韓慶梅;萬磊;盧永燦;張傳鵬;劉敏;馬洪華;金海鋒;馮建海
• 申請（專利權(quán)）人: 山東興瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N5/10;C12N15/867;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 山東華君知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37300
• 代理人: 張儉偉

1.抗Claudin18A2嵌合抗原受體，其特征在于，包括依序連接的CD8αLeader、Claudin18A2抗原結(jié)合區(qū)、CD8Hinge區(qū)、 CD8跨膜區(qū)、CD28共刺激區(qū)、4-1BB共刺激區(qū)、CD3ζ信號傳導(dǎo)區(qū)；

所述CD8αLeader的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Claudin18A2抗原結(jié)合區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述CD8 Hinge區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述CD8跨膜區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述CD28共刺激區(qū)的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；所述4-1BB共刺激區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述CD3ζ信號傳導(dǎo)區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.如權(quán)利要求1所述的抗Claudin18A2嵌合抗原受體，其特征在于，所述抗Claudin18A2嵌合抗原受體采用包括如下步驟的方法制備得到： (1)分別按CD8αLeader、Claudin18A2抗原結(jié)合區(qū)、CD8Hinge區(qū)、 CD8跨膜區(qū)、 CD28共刺激區(qū)、4-1BB共刺激區(qū)、CD3ζ信號傳導(dǎo)區(qū)合成其整個(gè)表達(dá)框并插入克隆載體pUC57上得到pUC-Claudin18A2； (2)將pUC-Claudin18A2進(jìn)行雙酶切，利用瓊膠電泳將含有Claudin18A2DNA片段瓊膠部位切下，利用DNA extractionkit溶膠液處理、過DF柱棄濾液、漂洗DF柱、空離、洗脫DF柱、收集離心物，得到純化的Claudin18A2 DNA片段，即所述的抗Claudin18A2嵌合抗原受體。

3.表達(dá)如權(quán)利要求1所述抗Claudin18A2嵌合抗原受體的T細(xì)胞，其特征在于：所述T細(xì)胞含有如上所述抗Claudin18A2嵌合抗原受體的重組表達(dá)載體、且該T細(xì)胞敲除了PD-1基因。

4.如權(quán)利要求3所述的T細(xì)胞，其特征在于，重組表達(dá)載體采用如下步驟制備得到：分別按CD8αLeader、Claudin18A2抗原結(jié)合區(qū)、CD8Hinge區(qū)、 CD8跨膜區(qū)、 CD28共刺激區(qū)、4-1BB共刺激區(qū)、CD3ζ信號傳導(dǎo)區(qū)合成其整個(gè)表達(dá)框并插入pLent-EF1α載體BamHI-NotI位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化到E.coli，經(jīng)測序正確后，提取質(zhì)粒，獲得重組表達(dá)載體pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2。

5.如權(quán)利要求3所述的T細(xì)胞，其特征在于，所述T細(xì)胞的制備方法包括如下步驟： S1、將T細(xì)胞的PD-1基因進(jìn)行敲除后，利用磁珠分選； S2、將獲得的敲除PD-1的T細(xì)胞大量擴(kuò)增后，利用慢病毒顆粒對上述T細(xì)胞進(jìn)行病毒感染，獲得表達(dá)CAR-Claudin18A2的T細(xì)胞。

6.如權(quán)利要求1所述的抗Claudin18A2嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞在制備治療胃癌的藥物中的用途。

7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于：所述藥物的形式包括試劑盒，所述試劑盒，包括 (1)獲得如上所述的穩(wěn)定表達(dá)抗Claudin18A2嵌合抗原受體、且敲除PD-1基因的T細(xì)胞；(2)稀釋液。