[發(fā)明專利]一種CD40聯(lián)合PD-L1及細(xì)胞因子擴(kuò)增PBMC的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811107312.7
• 申請日: 2018-09-21
• 公開（公告）號: CN109251891B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 古彥錚;張學(xué)光;黃子逸;劉翠平
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 北京知果之信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11541
• 代理人: 唐海力;韓來兵

本發(fā)明公開了一種CD40聯(lián)合PD?L1及細(xì)胞因子擴(kuò)增PBMC的方法，步驟如下：1）取正常人外周血，與PBS混合稀釋后進(jìn)行Ficoll密度梯度離心；2）離心結(jié)束后，得到4層液體；用移液管吸取中間云霧層細(xì)胞，用10倍體積的PBS洗滌離心，得到PBMC；3）將PBMC細(xì)胞用RMPI1640完全培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入6孔板和24孔板里，然后于各組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入相應(yīng)細(xì)胞因子液：將孔板放到CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；4）視細(xì)胞狀態(tài)每隔2~3天補加一次細(xì)胞因子液。本發(fā)明從CD40信號聯(lián)合PD?L1及細(xì)胞因子IL?15和IL?7組合擴(kuò)增PBMC制備新型過繼免疫治療細(xì)胞為切入點，提供一種新的過繼免疫細(xì)胞的體外誘導(dǎo)方案。此外，本發(fā)明所提供的方法實驗設(shè)備要求低、操作簡單省時、過繼免疫細(xì)胞的收集率高、純度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種CD40聯(lián)合PD-L1及細(xì)胞因子擴(kuò)增PBMC的方法 。

背景技術(shù)

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病之一。目前，手術(shù)、放療、化療仍是主要的處理方法。但復(fù)發(fā)率和死亡率還是很高。過繼細(xì)胞免疫治療（ACT）正成為當(dāng)今繼放化療后治療惡性腫瘤的一種新的治療手段，主要通過致敏淋巴細(xì)胞（具有特異免疫力的）輸給腫瘤病人，使其獲得抗腫瘤免疫力。

過繼免疫療法的效應(yīng)細(xì)胞具有異質(zhì)性，如細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）、自然殺傷細(xì)胞（NK）、巨噬細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(lymphokine-activatedkillercells, LAK)和腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lympbocytes，TIL)等都在腫瘤細(xì)胞殺傷中起作用。

外周血單個核細(xì)胞（PBMC），是指外周血中具有單個核的細(xì)胞，包含淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞（monocyte）、樹突狀細(xì)胞和其它少量細(xì)胞（造血干細(xì)胞等）。

新型過繼免疫細(xì)胞細(xì)胞治療技術(shù)是將人外周血單個核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子(CD3McAb，IL-2, IFN-γ,IL-1α等)共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群以 CD3⁺CD56⁺、CD3⁺CD8⁺細(xì)胞為主的異質(zhì)細(xì)胞群，增殖速度快、殺瘤活性、高殺瘤譜廣、對多重耐藥腫瘤細(xì)胞敏感，對G0期細(xì)胞也有殺傷作用、殺瘤活性不受環(huán)抱素A(CsA)和FKSO6等免疫抑制劑的影響、對正常骨髓造血前體細(xì)胞毒性小、能抵抗腫瘤細(xì)胞引發(fā)的效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)Fas-FasL分子途徑介導(dǎo)的凋亡。

常規(guī)以CD3McAb聯(lián)合細(xì)胞因子IL-2, IFN-γ,IL-1α誘導(dǎo)的新型過繼免疫細(xì)胞細(xì)胞治療仍然存在著很多亟待解決的問題：由于用IL-2維持后期T細(xì)胞的增殖，而IL-2誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞中負(fù)性共刺激分子PD-1/PD-L1比例相當(dāng)高。并且大劑量IL-2的應(yīng)用會誘導(dǎo)一定數(shù)量的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），這可能是影響新型過繼免疫細(xì)胞療效的關(guān)鍵因素。

發(fā)明內(nèi)容

本申請的主要目的在于提供一種新的CD40聯(lián)合PD-L1及細(xì)胞因子擴(kuò)增PBMC的方法。需要說明的是，本發(fā)明所提供的方法是一種過繼免疫細(xì)胞的體外誘導(dǎo)方法，并非是針對活體的研究，也并非是以疾病治療為直接目的的。

負(fù)性共刺激分子在T細(xì)胞的表達(dá)在T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。PD-1是55KD的跨膜蛋白，由胞外的IgV樣基序、跨膜區(qū)、胞內(nèi)的ITIM（immun oreceptortyrosine-based inhibitory motif）和ITSM（immunoreceptor tyrosine-based switchmotif）基序組成。它表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等，并在細(xì)胞活化后上調(diào)表達(dá)。PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后，可導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡和衰竭、T細(xì)胞耐受、改變細(xì)胞因子的分泌、增殖減弱和效應(yīng)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性降低，不能產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。