[發明專利]一種CD40聯合PD-L1及細胞因子擴增PBMC的方法有效
| 申請號： | 201811107312.7 | 申請日： | 2018-09-21 |
| 公開（公告）號： | CN109251891B | 公開（公告）日： | 2021-10-22 |
| 發明（設計）人： | 古彥錚;張學光;黃子逸;劉翠平 | 申請（專利權）人： | 蘇州大學附屬第一醫院 |
| 主分類號： | C12N5/078 | 分類號： | C12N5/078 |
| 代理公司： | 北京知果之信知識產權代理有限公司 11541 | 代理人： | 唐海力;韓來兵 |
| 地址： | 215007 *** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 cd40 聯合 pd l1 細胞因子 擴增 pbmc 方法 | ||
1.一種CD40聯合PD-L1及細胞因子擴增PBMC的方法，其特征在于，包括如下步驟：
1）取正常人外周血，與PBS混合稀釋后進行Ficoll密度梯度離心；
2）離心結束后，得到4層液體；用移液管吸取中間云霧層細胞，然后用10倍體積的PBS洗滌離心，最后得到PBMC；
3）將PBMC細胞用RMPI1640完全培養基配成細胞懸液，然后轉入6孔板和24孔板里，然后于各組細胞培養液中加入相應細胞因子液：然后將孔板放到CO2培養箱內培養；
4）視細胞狀態每隔2~3天補加一次細胞因子液；
其中，所述細胞培養液中加入相應細胞因子液，其過程為：
CD40激發組，起始時，即第0天，加入濃度為2μg/ml的5C11，濃度為1μg/ml的PD-L1，濃度為30ng/ml的抗CD3mAb，濃度為300U/ml的IL-2，濃度為5ng/ml的IL-7，濃度為5ng/ml的IL-15;
其中，補加細胞因子液時，CD40激發組，補加濃度為200U/ml的IL-2、濃度為2ng/ml的IL-7、濃度為2ng/ml的IL-15。
2.根據權利要求1所述的CD40聯合PD-L1及細胞因子擴增PBMC的方法，其特征在于，所述的Ficoll密度梯度離心為：先將提前置于室溫條件的Ficoll加入華氏管中，然后按照Ficoll：稀釋血液=1：2的比例，沿管壁緩慢加入稀釋血液，然后于控溫離心機中離心。
3.根據權利要求1所述的CD40聯合PD-L1及細胞因子擴增PBMC的方法，其特征在于，所述的CO2培養箱內培養條件為：CO2濃度為5%、溫度為37℃、飽和濕度95%。
4.根據權利要求1所述的CD40聯合PD-L1及細胞因子擴增PBMC的方法，其特征在于，所述的離心，條件為1800rpm/min，30min，20~24℃。
5.根據權利要求1所述的CD40聯合PD-L1及細胞因子擴增PBMC的方法，其特征在于，所述的RMPI1640完全培養基含10%小牛血清。
6.根據權利要求1所述的CD40聯合PD-L1及細胞因子擴增PBMC的方法，其特征在于，所述的6孔板為：5.0×106/孔；所述的24孔板為：2.0×105/孔。
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