[發明專利]一種水牛睪丸精子細胞分離和鑒定方法

在審

• 申請號: 201811103634.4
• 申請日: 2018-09-20
• 公開（公告）號: CN109182254A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 張明;張鵬飛;黃愉淋;侯振
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076;C12Q1/02
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司 11588
• 代理人: 蘇雪雪

本發明屬于精子細胞處理技術領域，具體涉及一種水牛睪丸精子細胞分離和鑒定方法，其主要包括以下步驟：1)獲得水牛睪丸，用膠原酶IV、透明質酸酶和DNase I組合酶法消化，細胞篩過濾，差異貼壁后取懸浮細胞；2)取懸浮細胞進行活細胞染色；3)流式細胞儀分選。有益效果：本技術方案為行之有效的水牛精子細胞分離方法，通過使用雙酶法分解牛睪丸組織，得到單細胞懸液，采用連續差異貼壁法去除體細胞的干擾，再采用流式細胞儀根據未貼壁細胞染色后的熒光強弱，判斷細胞DNA含量，有效消化和去除了二倍體精原細胞和四倍體初級經母細胞等其他非目標細胞的干擾，實現大量單倍體精子細胞的成功分選。

技術領域

本發明屬于精子細胞處理技術領域，具體涉及一種水牛睪丸精子細胞分離和鑒定方法。

背景技術

精子細胞是一種單倍體細胞，屬于睪丸生精細胞類型之一，在第二次減數分裂末期完成時產生。它是精子發生、成熟、形成功能性精子過程中第二次成熟分裂的結果，經過變形后形成精子。近年來，精子細胞顯微注射授精技術已經成為輔助生殖的重要技術，高活率高純度的精子細胞的獲得在以后生殖醫學的研究具有更廣闊的前景。

目前常用的分離精子細胞的方法有密度梯度離心法和重力沉降法，但其步驟繁瑣，對操作者經驗要求較高，且分離得到的細胞純度較低，分離的時間較長，細胞長時間處于非培養條件下，容易受到損傷。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供的一種操作簡單、細胞純度高的水牛精子細胞分離及相應的細胞鑒定方法。

具體技術方案是：一種水牛睪丸精子細胞分離和鑒定方法，其主要包括以下步驟：

1)獲得水牛睪丸，用膠原酶IV、透明質酸酶和DNase I組合酶法消化，細胞篩過濾，差異貼壁后取懸浮細胞；

2)取懸浮細胞進行活細胞染色；

3)采用流式細胞儀根據細胞形態和染色情況進行分選，獲得水牛精子細胞；

4)對獲得水牛精子細胞進行鑒定。

優選的，水牛睪丸分離精子細胞及鑒定方法中步驟1)具體操作方法如下：

1)向裝有組織的容器中加10倍體積的膠原酶IV溶液，37℃恒溫搖床孵育15min；

2)加入適量透明質酸酶和DNase I，37℃恒溫搖床孵育15min；

3)移液槍吹打組織至完全散開，無明顯的組織塊，離心棄上清，如此再重復2次；加入適量trypsin/EDTA、DNase I，37℃消化15min；

4)加入同體積含血清培養基終止消化，離心后重懸細胞，依次用200目細胞篩和300目細胞篩過濾；將細胞懸液轉移到明膠覆蓋的培養皿中，差異貼壁培養，收集懸液備用。

優選的，水牛睪丸精子細胞分離和鑒定方法步驟1)涉及試劑濃度如下：

所述collagenase IV濃度為2.5mg/ml，透明質酸酶濃度為10mg/ml，所述胰酶濃度為2.5mg/ml，DNase I濃度為5mg/ml，含血清培養基為含10％FBS的DMEM/F12培養基，明膠濃度為1mg/ml。

優選的，水牛睪丸精子細胞分離和鑒定方法步驟1)中細胞連續差異貼壁培養條件為：37℃，CO₂濃度為5.5％的培養箱中培養4至6小時，收集上層懸浮細胞，重懸培養4至6小時，重復三次。

優選的，水牛睪丸精子細胞分離和鑒定方法步驟2)具體操作如下，采取的細胞染色液為Hoechst 33342，濃度5μg/ml；孵育條件為37℃，5％二氧化碳培養箱中孵育60min，用40μm過濾篩過濾，置冰上送流式分選。