[發(fā)明專利]一種水牛睪丸精子細(xì)胞分離和鑒定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811103634.4
• 申請(qǐng)日: 2018-09-20
• 公開（公告）號(hào): CN109182254A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張明;張鵬飛;黃愉淋;侯振
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/076
• 分類號(hào): C12N5/076;C12Q1/02
• 代理公司: 北京華仁聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11588
• 代理人: 蘇雪雪

1.一種水牛睪丸精子細(xì)胞分離和鑒定方法，其特征在于包括以下步驟：

1)獲得水牛睪丸，用膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶和DNase I消化，細(xì)胞篩過濾，差異貼壁后收集懸浮細(xì)胞；

2)取懸浮細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞染色；

3)采用流式細(xì)胞儀根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和染色情況進(jìn)行分選，獲得水牛精子細(xì)胞；

4)對(duì)獲得水牛精子細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水牛睪丸精子細(xì)胞分離和鑒定方法，其特征在于步驟1)的具體方法如下：

1)向裝有水牛睪丸組織的容器中加10倍體積的膠原酶IV溶液，37℃恒溫?fù)u床孵育15min；

2)加入適量透明質(zhì)酸酶和DNase I，37℃恒溫?fù)u床孵育15min；

3)移液槍吹打組織至完全散開，無明顯的組織塊，離心棄上清，如此再重復(fù)2次；加入胰酶/EDTA、DNase I，37℃消化15min；

4)加入同體積含血清培養(yǎng)基終止消化，離心后重懸細(xì)胞，依次用200目細(xì)胞篩和300目細(xì)胞篩過濾；將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到明膠覆蓋的培養(yǎng)皿中，差異貼壁培養(yǎng)，收集懸液備用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水牛睪丸精子細(xì)胞分離和鑒定方法，其特征在于涉及溶液濃度如下：

所述膠原酶IV濃度為2.5mg/ml，透明質(zhì)酸酶濃度為10mg/ml，所述胰酶濃度為2.5mg/ml，DNase I濃度為5mg/ml，含血清培養(yǎng)基為含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，明膠濃度為1mg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水牛睪丸精子細(xì)胞分離和鑒定方法，其特征在于步驟4)中細(xì)胞連續(xù)差異貼壁培養(yǎng)條件為：37℃，CO₂濃度為5.5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4至6小時(shí)，收集上層懸浮細(xì)胞，重懸培養(yǎng)4至6小時(shí)，重復(fù)三次。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水牛睪丸精子細(xì)胞分離和鑒定方法，其特征在于步驟2)中采用細(xì)胞染色液為Hoechst 33342，濃度5μg/ml；孵育條件為37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育60min，用40μm過濾篩過濾，置冰上送流式分選。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水牛睪丸精子細(xì)胞分離和鑒定方法，其特征在于步驟3)中流式細(xì)胞儀選用70μm噴嘴，鞘液壓力70psi；根據(jù)DNA含量設(shè)門分選；分選中的前向散射光電壓為150V，側(cè)向散射光電壓為245V，Hoechst-blue通道的電壓為230V；保持進(jìn)樣速率約為10000個(gè)/s，接收管中預(yù)先加入200μl培養(yǎng)液。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的水牛睪丸精子細(xì)胞分離和鑒定方法，其特征在于所述DNA含量設(shè)門為：以二倍體體細(xì)胞為參照，劃定單倍體細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門。