[發(fā)明專利]一種檢測(cè)卡那霉素的均相生物傳感方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811099210.5
• 申請(qǐng)日: 2018-09-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109283147B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賴國(guó)松;陳志超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北師范大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/31
• 分類號(hào): G01N21/31
• 代理公司: 黃石市三益專利商標(biāo)事務(wù)所 42109
• 代理人: 林曉珍

一種檢測(cè)卡那霉素的均相生物傳感方法及其應(yīng)用，通過(guò)G?四鏈體DNA（S1）與卡那霉素核酸適配體（S2）的雙鏈雜交反應(yīng)抑制DNA酶活性，而卡那霉素與其核酸適配體之間的特異性結(jié)合釋放對(duì)應(yīng)數(shù)量的S1，并結(jié)合氯化血紅素形成DNA酶進(jìn)行催化顯色信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；此外，卡那霉素與其核酸適配體之間形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以在引入互補(bǔ)鏈S3雜交之后，通過(guò)核酸外切酶III的催化目標(biāo)分析物循環(huán)來(lái)提高方法的靈敏度；利用核酸適配體特異性識(shí)別釋放的DNA酶的催化顯色反應(yīng)，構(gòu)建顯色產(chǎn)物吸光度與卡那霉素分析物濃度之間的定量關(guān)系；本發(fā)明操作方便，成本低廉，靈敏度高，穩(wěn)定性好，對(duì)于食品、水體等復(fù)雜介質(zhì)中卡那霉素殘留的快速檢測(cè)具有很好應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種檢測(cè)卡那霉素的均相生物傳感方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

卡那霉素是一種的氨基糖苷類高效廣譜抗生素，對(duì)多數(shù)腸桿菌科細(xì)菌如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、變形桿菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬、普羅菲登菌屬、耶爾森菌屬，以及流感嗜血桿菌、布魯菌屬、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等均有良好抗菌作用，因而被廣泛用于人和動(dòng)物各種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌感染性疾病的治療。然而，卡那霉素的過(guò)量使用不僅可以引起聽(tīng)力減退、耳鳴，甚至腎毒性反應(yīng)和藥物過(guò)敏等嚴(yán)重的副作用，而且還會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性。近年來(lái)，抗生素的濫用引起的食物、水體、土壤中抗生素殘留超標(biāo)及其通過(guò)食物鏈在人體中的富集對(duì)人類健康產(chǎn)生了的極大威脅，引起了社會(huì)普遍關(guān)注。因此，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家和地區(qū)都對(duì)食物中卡拉霉素等抗生素殘留提出了嚴(yán)格的限制標(biāo)準(zhǔn)。

目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)一般采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法來(lái)進(jìn)行卡那霉素殘留的檢測(cè)，但是該方法儀器昂貴，檢測(cè)成本高，且一般只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，很難滿足實(shí)際應(yīng)用中實(shí)時(shí)、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。為解決這一問(wèn)題，近年來(lái)人們將抗原（抗體）、DNA等生物識(shí)別作用與電化學(xué)、比色等分析方法相結(jié)合，發(fā)展了大量可用于抗生素快速、方便檢測(cè)的生物傳感方法。但是，這些方法一般都是基于異相分析模式而構(gòu)建，往往需要十分繁瑣的固相界面修飾，以及多步溫育、分離和洗滌操作，甚至還要結(jié)合納米材料信號(hào)放大來(lái)提高其分析靈敏度，因而不僅分析時(shí)間較長(zhǎng)，操作繁瑣，而且多步操作還會(huì)一定程度上影響方法的重復(fù)性，提高分析成本，十分不利于其廣泛使用。因此，發(fā)展一種操作簡(jiǎn)單，且具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、成本低廉等優(yōu)良性能的智能型生物傳感新方法具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是針對(duì)目前檢測(cè)卡拉霉素的方法操作繁瑣、成本較高、時(shí)間較長(zhǎng)、重復(fù)性不好等問(wèn)題，提供一種可簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)樣品中卡拉霉素含量的均相生物傳感方法，該方法操作方便，成本低廉，靈敏度高，穩(wěn)定性好，分析時(shí)間較短，對(duì)操作人員的要求低，對(duì)于食品、水體等復(fù)雜介質(zhì)中卡拉霉素殘留現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明的一種檢測(cè)卡那霉素（Kana）的均相生物傳感方法，包括以下步驟：

（1）G-四鏈體特征序列與卡那霉素核酸適配體雜交雙鏈制備

向PV管中加入990μL濃度為10mM pH=7.4 三（羥甲基）氨基甲烷緩沖溶液，所述緩沖溶液中含有200mM NaCl、10mM KCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% DMSO和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05% Triton X-100，再向其中加入5μL 10μM G-四鏈體DNA鏈（S1）和5μL 10μM 卡那霉素核酸適配體（S2）溶液，所述G-四鏈體DNA鏈（S1）的堿基序列為5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGA ACC TCA AGACCA CTT GGA CAT TTT-3’，所述卡那霉素核酸適配體（S2）的堿基序列為5’-TGT CCA AGTGGT CTT GAG GTT TTTT-3’，室溫震蕩反應(yīng)45min后得到適配體雜交雙鏈復(fù)合物溶液待用；

（2）均相反應(yīng)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液中卡那霉素（Kana）的含量