[發(fā)明專利]一種檢測卡那霉素的均相生物傳感方法及其應用

有效

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• 申請日: 2018-09-20
• 公開（公告）號: CN109283147B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設計）人: 賴國松;陳志超
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北師范大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 黃石市三益專利商標事務所 42109
• 代理人: 林曉珍

1.一種檢測卡那霉素的均相生物傳感方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）G-四鏈體特征序列與卡那霉素核酸適配體雜交雙鏈制備

向PV管中加入990μL濃度為10mM pH=7.4 三（羥甲基）氨基甲烷緩沖溶液，所述緩沖溶液中含有200mM NaCl、10mM KCl、質(zhì)量分數(shù)為1% DMSO和質(zhì)量分數(shù)為0.05% Triton X-100，再向其中加入5μL 10μM G-四鏈體DNA鏈和5μL 10μM 卡那霉素核酸適配體溶液，所述G-四鏈體DNA鏈的堿基序列為5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGA ACC TCA AGA CCA CTT GGA CATTTT-3’，所述卡那霉素核酸適配體的堿基序列為5’-TGT CCA AGT GGT CTT GAG GTT TTTT-3’，室溫震蕩反應45min后得到適配體雜交雙鏈復合物溶液待用；

（2）均相反應測定標準溶液中卡那霉素的含量

取6份上述適配體雜交雙鏈復合物溶液各100μL，向其中分別加入含有卡拉霉素的濃度梯度為0.0001ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL和10ng/mL 20mM pH=7.4Tris-HCl緩沖溶液50μL，該緩沖溶液中含有100mM NaCl，2mM MgCl₂和5mM KCl，再向每份溶液中加入5μL 2μM 卡那霉素核酸適配體部分互補序列、5μL 5U/μL核酸外切酶III以及5μL1μM的氯化血紅素，所述卡那霉素核酸適配體部分互補序列中的堿基序列為5’-AAA AAACCT GAC ACT AC-3’；37℃渦旋混勻反應70min后，升高溫度至65℃，保持5min后降至25℃；接著向每份溶液中加入70μL含有0.4mM TMB、0.4mM H₂O₂的pH=5.0檸檬酸鹽緩沖溶液，該緩沖溶液中含有95.8mM Na₂HPO₄、52.1mM檸檬酸鈉和40mM KCl，顯色反應5min之后，繼續(xù)向其中加入30μL 2M H₂SO₄終止顯色反應；利用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度值，以建立吸光度與卡那霉素濃度之間的定量關系；

（3）樣品中卡那霉素含量的檢測

取適量的樣品并進行前處理，取處理后的樣品溶液50μL，向其中加入100μL適配體雜交雙鏈復合物溶液、5μL 2μM 卡那霉素核酸適配體部分互補序列、5μL 5U/μL核酸外切酶III以及5μL 1μM的氯化血紅素，所述卡那霉素核酸適配體部分互補序列中的堿基序列為5’-AAA AAA CCT GAC ACT AC-3’；37℃渦旋混勻反應70min后，升高溫度至65℃，保持5min后降至25℃；接著向樣品溶液中加入70μL含有0.4mM TMB和0.4mM H₂O₂的pH=5.0檸檬酸鹽緩溶液，該緩沖溶液中含有95.8mM Na₂HPO₄、52.1mM檸檬酸鈉和40mM KCl，顯色反應5min之后，繼續(xù)向其中加入30μL 2M H₂SO₄終止顯色反應；利用紫外-可見分光光度計測定樣品溶液的吸光度值，根據(jù)吸光度與卡那霉素濃度之間的定量關系計算卡那霉素的含量。

2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測卡那霉素的均相生物傳感方法在檢測樣品中卡那霉素含量中的應用。