[發明專利]用于硫嘌呤類藥物的用藥相關基因分型試劑盒和分型方法

在審

• 申請號: 201811098669.3
• 申請日: 2018-09-20
• 公開（公告）號: CN109486932A
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 周連群;李金澤;張芷齊;李傳宇;姚佳;張威;郭振
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6886;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 李敏

1.一種用于硫嘌呤類藥物的用藥相關基因分型試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括核酸擴增試劑、基于硫嘌呤類藥物的個體化用藥相關基因設計的引物和熒光探針，所述核酸擴增試劑包括納米二氧化硅。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述納米二氧化硅的粒徑為50～500nm。優選的，所述納米二氧化硅為球狀。

3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸擴增試劑中還包括DNA聚合酶、dNTPs、擴增緩沖液和非離子型表面活性劑中的至少一種。

4.根據權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸擴增試劑，包括如下濃度的成分：

Taq酶，100～500mg/L；

dNTPs，50～200g/L；

Tris-HCl，0.5～2mL/L；

MgCl₂，10～40g/L；

KCl，5～20g/L；

(NH₄)₂SO₄，5～40g/L；

納米二氧化硅，20～100g/L；

Triton X-100，1～5mL/L。

5.根據權利要求1-4任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述引物或熒光探針的濃度為100～300mg/L。優選的，所述引物或熒光探針的濃度為200mg/L。

6.根據權利要求1-5任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述引物和熒光探針是基于TPMT基因的rs1142345位點和NUDT15基因的rs116855232位點中的至少一種設計的。

7.根據權利要求1-6任一項所述的試劑盒，其特征在于，基于TPMT基因的rs1142345位點設計的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示，熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：3-4所示；

基于NUDT15基因的rs116855232位點設計的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示，熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：7-8所示。

8.根據權利要求1-7任一項所述的試劑盒，其特征在于，還包括核酸提取試劑，所述核酸提取試劑包括紅細胞裂解液，所述細胞裂解液包括溶液A和溶液B，所述溶液A為甲酸濃度為1～5mL/L的水溶液，溶液B為含碳酸鈉4～8g/L、氯化鈉10～20g/L和硫酸鈉25～40g/L的水溶液；和/或，

所述核酸提取試劑包括核酸釋放液，所述核酸釋放液包括蛋白酶K濃度為10～40g/L、RNase濃度為5～20g/L、EDTA濃度為5～20g/L的水溶液。

9.根據權利要求1-8任一項所述的試劑盒在硫嘌呤類藥物的個體化用藥相關基因分型中的應用。

10.一種利用權利要求1-9任一項所述的試劑盒進行硫嘌呤類藥物的用藥相關基因分型的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、向待測血液中加入紅細胞裂解液的溶液A，震蕩混合，然后再加入紅細胞裂解液的溶液B，震蕩混合，隨后進行離心、棄上清，重懸細胞；重復以上裂解步驟至少一次，得到細胞裂解液；

S2、向細胞裂解液中加入核酸釋放液，在63-67℃下處理5-10分鐘，然后在100-120℃下處理30-60秒，得到核酸樣本；

S3、以步驟S2中獲得的核酸樣本為模板，加至核酸擴增試劑、引物和熒光探針的預混液中，進行實時熒光定量PCR檢測。

優選的，在S3步驟中，實時熒光定量PCR的反應程序為：熱啟動，95℃保持5分鐘；熱循環，循環40次，每循環為95℃保持15秒；最后58～62℃保持30秒。