[發明專利]檢測蓮草直胸跳甲CP基因表達特性的引物及其方法有效
| 申請號： | 201811095254.0 | 申請日： | 2018-09-19 |
| 公開（公告）號： | CN109022598B | 公開（公告）日： | 2021-06-22 |
| 發明（設計）人： | 張烜華;陳武星;曾華;林荔 | 申請（專利權）人： | 張烜華 |
| 主分類號： | C12Q1/6888 | 分類號： | C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11 |
| 代理公司： | 福州元創專利商標代理有限公司 35100 | 代理人： | 蔡學俊 |
| 地址： | 350001*** | 國省代碼： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 檢測 蓮草直胸跳甲 cp 基因 表達 特性 引物 及其 方法 | ||
1.一種檢測蓮草直胸跳甲CP基因表達特性的熒光定量PCR特異性引物，其特征在于：所述引物包括符合熒光定量PCR反應特點的上下游引物：
CP-F：5`-TGTAGCAACGGGAGCAGATA-3`，
CP-R：5`-TACGCCGCACCTGTATCATA-3`；
以及作為內參基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3` ，
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`。
2.一種利用權利要求1所述特異性引物檢測蓮草直胸跳甲CP基因表達特性的熒光定量PCR方法，其特征在于：包括如下步驟：
（1）cDNA第一鏈合成：提取樣本的總RNA并純化，采用反轉錄試劑盒得到以提取的RNA為模板反轉錄得到的cDNA；
（2）利用下述引物進行常規PCR檢測
該基因的熒光定量上下游引物：
CP-F：5`-TGTAGCAACGGGAGCAGATA-3`，
CP-R：5`-TACGCCGCACCTGTATCATA-3`；
以及作為內參基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`，
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`；
常規PCR擴增體系為25μL：10×buffer 2.5μL ，dNTP 1.0μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，100ng/μL cDNA模板1.0μL，Ex-TaqE 0.15μL，水19.35μL；
常規PCR反應程序為：94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s， 56℃退火30 s， 72℃延伸1 min，此條件下35個循環，最后72℃再延伸10min；
（3）實時熒光定量PCR反應：
以步驟（1）得到的cDNA為模板，加入步驟（2）所述的引物，進行熒光定量PCR反應，每個樣品設置3個重復，擴增后取平均值；
實時熒光定量PCR擴增體系為：SYBR? Premix Ex TaqTM 12.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，100ng/μL cDNA 1.0μL，補足水至25μL；
實時熒光定量PCR反應程序為：95℃預變性 30 s，然后95℃變性5 s 、60℃退火30 s，40個循環。
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