[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)鴨坦布蘇病毒E蛋白抗體的膠體金檢測(cè)卡

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811094428.1
• 申請(qǐng)日: 2018-09-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109061195A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈仁勇;鄧杰;劉艷紅;程安春;汪銘書(shū);陳舜;朱德康;劉馬鋒;孫昆峰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68;G01N33/558;G01N33/569
• 代理公司: 成都中亞專(zhuān)利代理有限公司 51126
• 代理人: 何淵

1.一種檢測(cè)鴨坦布蘇病毒E蛋白抗體檢測(cè)卡，包括外殼（1）和置于外殼內(nèi)的試紙條（2），所述外殼（1）上開(kāi)有觀測(cè)窗（11）和加樣孔（12）；所述試紙條（2）由樣品墊（21）、金標(biāo)墊（22）、硝酸纖維素膜（23）、吸收墊（24）順次搭接粘貼在PVC底板（25）上構(gòu)成，確保接頭處有疊壓，使層析能順利進(jìn)行；其中所述金標(biāo)墊（22）上結(jié)合有金標(biāo)E蛋白和金標(biāo)羊抗鼠IgG，所述硝酸纖維素膜上有一條含有鴨坦布蘇病毒E蛋白的T線（26）和另一條含有鼠IgG的C線（27）；

包括以下步驟：

（1）金標(biāo)羊鼠IgG的制備：將羊抗鼠IgG加入膠體金溶液中，用0.1mol/L的K₂CO₃溶液調(diào)節(jié)pH值至6.7；

（2）金標(biāo)E蛋白的制備：將E蛋白加入膠體金溶液中，用0.1mol/L的K₂CO₃溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8；

（3）硝酸纖維素膜的制備：用E蛋白和鼠IgG分別在層析膜上劃線（0.9-1.1mm）作為T(mén)線和C線，T線和C線間距約為7mm，凍干并4℃保存；

（4）膠體金溶液的制備：在超純水中加入1％氯金酸，加熱煮沸，迅速加入1％檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸15分鐘，所述超純水、氯金酸、檸檬酸三鈉的體積比為99：1：1，冷卻后用超純水恢復(fù)至原來(lái)的體積，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）金標(biāo)墊的制備：免疫膠體金溶液均勻鋪至金標(biāo)墊，37℃作用2h，凍干并4℃保存；

（6）組裝檢測(cè)卡：將吸水濾紙職稱(chēng)的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸收墊依次貼到一張帶不干膠的PVC底板上，組裝成試紙條，然后將試紙條裝入外殼，組裝成檢測(cè)卡。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)卡，其特征在于：所述E蛋白由鴨坦布蘇病毒CQW1株經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)體外誘導(dǎo)表達(dá)并純化所得，其蛋白分子量大小約65KD。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)卡，其特征在于：所以免疫膠體金溶液的純化方法如下：采用低溫高速離心法除去未標(biāo)記的蛋白、未充分標(biāo)記的金顆粒和標(biāo)記過(guò)程中可能形成的各種聚合物，以達(dá)到金標(biāo)復(fù)合物的純化，然后用金標(biāo)復(fù)合物稀釋液混懸兩種金標(biāo)復(fù)合物的沉淀至原體積的10%，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.一種根據(jù)權(quán)利要求1~3任意所述的檢測(cè)卡在檢測(cè)鴨坦布蘇病毒E蛋白抗體中的應(yīng)用。

5.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：采用權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的膠體金檢測(cè)卡，將血清樣品經(jīng)加樣孔滴加到樣品墊上，通過(guò)微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細(xì)作用，樣品在層析紙條上前移，并與金標(biāo)墊上的免疫膠體金反應(yīng)，形成“金標(biāo)E蛋白-抗體”復(fù)合物；當(dāng)T線和C線均顯色時(shí)，結(jié)果為陽(yáng)性；僅C線顯色時(shí)，結(jié)果為陰性；當(dāng)T線和C線均不顯色，考慮檢測(cè)卡失效。