[發(fā)明專(zhuān)利]一種豬瘟病毒和豬偽狂犬病毒的二聯(lián)金標(biāo)檢測(cè)試紙及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811091645.5
• 申請(qǐng)日: 2018-09-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109187968B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張改平;王愛(ài)萍;陳玉梅;劉東民;周景明;王彥偉;祁艷華;劉燕凱;劉紅亮;秦云飛;李永欣
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 鄭州大學(xué);河南中澤生物工程有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/569
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/569;G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 鄭州市華翔專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛(ài)軍

1.一種豬瘟病毒和豬偽狂犬病毒的二聯(lián)金標(biāo)檢測(cè)試紙，包括支撐板(1)和固定在支撐板(1)上的吸附層，吸附層從測(cè)試端開(kāi)始依次為樣品墊(3)、金標(biāo)墊、NC膜(2)和吸水墊(6)，其特征在于，金標(biāo)墊包括依次上下疊放設(shè)置在支撐板(1)上的上層金標(biāo)墊(4)和下層金標(biāo)墊(5)，在下層金標(biāo)墊(5)上吸附有膠體金標(biāo)記的抗豬瘟病毒單克隆抗體mAb1，在上層金標(biāo)墊(4)上吸附有膠體金標(biāo)記的抗豬偽狂犬病毒單克隆抗體mAb2，NC膜(2)上設(shè)有兔抗小鼠IgG抗體或金黃色葡萄球菌SPA印制的質(zhì)控線(xiàn)C(7)，抗豬瘟病毒單克隆抗體mAb3印制的檢測(cè)線(xiàn)T1(8)以及抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體mAb4印制的檢測(cè)線(xiàn)T2(9)；

抗豬瘟病毒單克隆抗體mAb1、mAb3的制備方法包括：1)豬瘟病毒免疫原的制備，2)抗豬瘟病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立，3)抗豬瘟病毒單克隆抗體的制備，4)抗豬瘟病毒單克隆抗體的純化，5)抗豬瘟病毒單克隆抗體的抗體效價(jià)鑒定，6)抗豬瘟病毒單克隆抗體識(shí)別抗原表位分析；

豬瘟病毒免疫原的制備：以豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株石門(mén)株接種豬腎細(xì)胞PK-15，制備病毒培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)離心、超濾濃縮，純化后，測(cè)定豬瘟病毒的半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID₅₀達(dá)10^-7以上，用純化的豬瘟病毒作為一種免疫原；同時(shí)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備并純化的豬瘟病毒E2蛋白作為另一種免疫原；

抗豬瘟病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立：將豬瘟病毒免疫原分別與弗氏免疫佐劑等量混合，充分乳化，以20μg/只免疫BALB/c小鼠3次，每次間隔15-21天；第3次免疫后分別用ELISA和IPMA測(cè)定免疫小鼠效價(jià)，選擇ELISA和IPMA效價(jià)高的小鼠，豬瘟病毒免疫原按50μg/只小鼠尾部靜脈注射進(jìn)行超免，超免后3-4天，處死小鼠無(wú)菌取其脾細(xì)胞用于細(xì)胞融合；將1×10⁸的脾細(xì)胞與2×10⁷的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合，PEG 4000誘導(dǎo)細(xì)胞融合，用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)7-10天后，取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清以ELISA和IPMA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞；選取強(qiáng)陽(yáng)性、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的克隆孔采用有限稀釋進(jìn)行3-5輪亞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存細(xì)胞，制備抗豬瘟病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株；

抗豬偽狂犬病毒單克隆抗體mAb2、mAb4的制備方法包括：a)豬偽狂犬病毒免疫原的制備，b)抗豬偽狂犬病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立，c)抗豬偽狂犬病毒單克隆抗體的制備，d)抗豬偽狂犬病毒單克隆抗體的純化，e)抗豬偽狂犬病毒單克隆抗體的抗體效價(jià)鑒定，f)抗豬偽狂犬病毒單克隆抗體識(shí)別抗原表位分析；

豬偽狂犬病毒免疫原的制備：以PRV新流行株湯陰株的gE蛋白為靶標(biāo)，優(yōu)化合成gE蛋白胞外區(qū)主要編碼區(qū)基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)gE蛋白并純化，即得；

抗豬偽狂犬病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立：將豬偽狂犬病毒免疫原分別與弗氏免疫佐劑等量混合，充分乳化，以20μg/只免疫BALB/c小鼠3次，每次間隔15-21天；第3次免疫后分別用ELISA和IPMA測(cè)定免疫小鼠效價(jià)，選擇ELISA和IPMA效價(jià)高的小鼠，豬偽狂犬病毒免疫原按50μg/只小鼠尾部靜脈注射進(jìn)行超免，超免后3-4天，處死小鼠無(wú)菌取其脾細(xì)胞用于細(xì)胞融合；將1×10⁸的脾細(xì)胞與2×10⁷的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合，PEG 4000誘導(dǎo)細(xì)胞融合，用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)7-10天后，取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清以ELISA和IPMA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞；選取強(qiáng)陽(yáng)性、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的克隆孔采用有限稀釋進(jìn)行3-5輪亞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存細(xì)胞，制備抗豬偽狂犬病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。