[發明專利]人類肺干細胞的分選方法

有效

• 申請號: 201811091544.8
• 申請日: 2018-09-19
• 公開（公告）號: CN110146700B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 陳懷永;吳琦;孫昕;李寬;張秋陽;武俊平;謝祎
• 申請（專利權）人: 天津市海河醫院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 楊歡

本發明涉及一種肺組織干細胞的分選方法，尤其是一種人類肺干細胞的分選方法。包括處理肺組織，抗體孵育以及流式分選等步驟，利用該方法分選人類肺干細胞可以直接對人類肺干細胞進行研究，首次解決了阻礙人類干細胞研究的難題。

技術領域

本發明涉及一種肺組織干細胞的分選方法，尤其是一種人類肺干細胞的分選方法。

背景技術

肺氣道上皮的修復存在多種機制。肺外干細胞（骨髓、外周血、胚胎等來源）可遷移到損傷的肺部，但是這些細胞對氣道上皮修復的貢獻，遠不及肺內干細胞。人類肺干細胞主要包括肺泡Ⅱ型細胞、Club細胞、基底細胞。肺干細胞的功能失調與多種肺疾病相關，包括哮喘、COPD、肺纖維化等等。但是，目前缺乏對人類肺干細胞功能研究的有效手段，嚴重阻礙了對人類肺干細胞的研究。盡管臨床檢驗可以一定程度上反應肺干細胞的功能及狀態，但是不能作為直接證據來研究干細胞的功能，加之志愿者難以募集，試驗階段療效不穩定等原因，進一步限制了科學工作者對肺干細胞的研究。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的缺陷，提供一種人類肺干細胞的分選方法。

本發明為實現上述目的，采用以下技術方案：

一種人類肺干細胞的分選方法,包括下述步驟：

1) 將肺組織剪成1cm³小塊,使用HBSS清洗(用冷HBSS洗，如果血過多，可以增加洗的遍數。注意：可以在4℃條件下，用HBSS，振蕩洗滌。)后，轉移至有蓋培養皿機械剁碎成肺靡(注意：用無塵紙巾擦干組織，同時，盡可能的去除內臟的胸膜腔。)，并轉移至50ml離心管中；

2）將37℃ Liberase TM加入到步驟1）得到的離心管中；添加比例為：每1cm³ 的肺組織添加10mL的工作液；

3）將步驟2）得到的離心管，放入混勻儀（Thermomixer，Eppendorf）中，1000 rpm，37℃，搖動45 min；取出，移液管上下吹打至大塊的組織分離開，繼續放入混勻儀，1000rpm，37℃，搖動15 min；確保制成單細胞懸浮液；

4）再次用10ml移液器上下吹打，利用多選擇性細胞過濾器，過濾肺組織消化液；濾去胞外基質；(注意：多選擇性細胞過濾器組成（從上到下）：粉紅色（500μm），橙色（300μm），黃色（100μm）和綠色（連接環）。濾過后，用20mL的含有2%FBS的HBSS清洗過濾器。)

5）用50ml含有2%FBS的HBSS重懸步驟4）得到的肺組織消化液，4℃，400g，離心5分鐘；(如果上清比較混沌，可以重新將上清收集到新的50mL離心管，離心，收集更多的細胞)傾倒或吸出上清液，用含有2%FBS的HBSS多次重懸肺組織細胞團；此處一般為2-3次；

6）傾倒或吸出上清液，用2-5mL紅細胞裂解液重懸細胞團，在冰上孵育2分鐘，期間溫和振蕩得到裂解液；

7）立即添加20mL含有2%FBS的HBSS，稀釋裂解液；4℃，400g，離心5分鐘，棄去上清，用移液管吸取1mL含有2%FBS的HBSS重懸細胞團，然后添加9mL含2%FBS的HBSS，總體積為10mL；

8）用70μM的過濾網，將細胞過濾到50mL離心管中，以濾掉紅細胞膜；4℃，400g，離心5分鐘，用含有2%FBS的HBSS重懸細胞；細胞計數；

9）抗體孵育；一抗7AAD PE-Cy5，Anti-Human CD326 (EpCAM) PE-Cyanine7，Anti-CD271 (NGF Receptor) PE，anti-human HTII，孵育45分鐘；二抗Anti-Human CD31(PECAM-1) Biotin，anti-human CD45 Biotin ，Streptavidin APC-eFluor? 780，孵育40分鐘；