[發明專利]人類肺干細胞的分選方法

有效

• 申請號: 201811091544.8
• 申請日: 2018-09-19
• 公開（公告）號: CN110146700B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 陳懷永;吳琦;孫昕;李寬;張秋陽;武俊平;謝祎
• 申請（專利權）人: 天津市海河醫院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 楊歡

1.一種人類肺干細胞的分選方法,其特征在于，包括下述步驟：

1) 將肺組織剪成1cm³小塊,使用HBSS清洗后，轉移至有蓋培養皿機械剁碎成肺糜，并轉移至50ml離心管中；

2）將37℃ Liberase TM加入到步驟1）得到的離心管中；添加比例為：每1cm³的肺組織添加10mL的Liberase TM工作液；該步驟中37℃ Liberase TM的制備方法為：將Liberase TM溶解在HBSS中，制備0.25 U/ml 的Liberase TM工作液，37℃孵育待用；

3）將步驟2）得到的離心管，放入混勻儀中，1000 rpm，37℃，搖動45 min；取出，移液管上下吹打至大塊的組織分離開，繼續放入混勻儀，1000 rpm，37℃，搖動15 min；確保制成單細胞懸浮液；

4）用10ml移液器上下吹打，利用多選擇性細胞過濾器，過濾肺組織消化液；濾去胞外基質；

5）用50ml含有2%FBS的HBSS重懸步驟4）得到的肺組織消化液，4℃，400g，離心5分鐘；傾倒或吸出上清液，用含有2%FBS的HBSS多次重懸肺組織細胞團；

6）傾倒或吸出上清液，用2-5mL紅細胞裂解液重懸細胞團，在冰上孵育2分鐘，期間溫和振蕩得到裂解液；

7）立即添加20mL含有2%FBS的HBSS，稀釋裂解液；4℃，400g，離心5分鐘，棄去上清，用移液管吸取1mL含有2%FBS的HBSS重懸細胞團，然后添加9mL含2%FBS的HBSS，總體積為10mL；

8）用70μM的過濾網，將細胞過濾到50mL離心管中，以濾掉紅細胞膜；4℃，400g，離心5分鐘，用含有2%FBS的HBSS重懸細胞；細胞計數；

9）抗體孵育；一抗7AAD PE-Cy5，Anti-Human CD326 PE-Cyanine7，Anti-CD271 PE，anti-human HTII，孵育45分鐘；二抗Anti-Human CD31 Biotin，anti-human CD45 Biotin，Streptavidin APC-eFluor? 780，孵育40分鐘；

10）流式分選；排除7AAD陽性細胞，CD31陽性細胞，CD45陽性細胞；選擇EpCAM陽性，HTII陽性，NGFR陰性為肺泡Ⅱ型細胞；選擇EpCAM陽性，HTII陰性，NGFR陰性為Club細胞；選擇EpCAM陽性，HTII陰性，NGFR陽性為基底細胞。