[發明專利]NADH依賴性的氨基酸脫氫酶及其在提高賴氨酸產量中的應用

在審

• 申請號: 201811089319.0
• 申請日: 2018-09-18
• 公開（公告）號: CN109182283A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 陳振;劉德華
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N9/06;C12N15/53;C12N15/63;C12P13/08;C12P13/00;A23K20/189;A23K10/18
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明提供了NADH依賴性的氨基酸脫氫酶在提高賴氨酸產量中的應用，所述氨基酸脫氫酶分別為來源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脫氫酶，來源于Tistrella mobilis的天冬氨酸半醛脫氫酶，來源于Mycobacterium tuberculosis的二氫吡啶二羧酸還原酶，來源于Tepidanaerobacter acetatoxydans的二氨基庚二酸脫氫酶，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO.1、3、5、7所示。本發明的氨基酸脫氫酶能利用NADH或同時利用NADH和NADPH作為輔因子合成賴氨酸從而減少細胞對NADPH的需求，進而顯著的提高賴氨酸或者戊二胺的產量。

技術領域

本發明屬于基因工程和生物發酵技術領域，具體地說，涉及一種NADH依賴性的氨基酸脫氫酶及其應用。

背景技術

賴氨酸是一種極其重要的氨基酸，廣泛應用于飼料添加劑、保健及醫藥領域。目前，賴氨酸的工業生產主要通過微生物發酵法進行，工業常用的菌種包括谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌。在賴氨酸的生物合成過程中，有四步酶促反應過程需要消耗NADPH用于合成賴氨酸。因此，傳統的方法都是通過強化NADPH的供應，例如提高戊糖磷酸循環途徑的代謝通量，或者表達NADPH依賴型的甘油醛3-磷酸脫氫酶，用于平衡賴氨酸合成過程中的輔酶需求，從而提高賴氨酸的產量。在戊二胺的生產過程中同樣存在高度依賴NADPH的問題，戊二胺是通過在賴氨酸生產菌株中表達賴氨酸脫羧酶脫而獲得。在微生物細胞內，NADH的濃度一般遠大于NADPH，且NADH的穩定性比NADPH更高，價格更加便宜，因此直接利用胞內的NADH合成賴氨酸或戊二胺具有極大的應用潛力。

發明內容

本發明的目的是提供一種NADH依賴性的氨基酸脫氫酶及其應用。

賴氨酸和戊二胺合成途徑中有四步反應消耗NADPH：(1)草酰乙酸的氨基化生成天冬氨酸；(2)磷酸天冬氨酸還原生成天冬氨酸半醛；(3)二氫吡啶二羧酸還原生成哌啶二羧酸；(4)哌啶二羧酸還原生成二氨基庚二酸。目前大部分微生物體內發現的催化上述步驟的酶都是嚴格依賴于NADPH。本發明通過大量的生物信息學分析和反復對比實驗，在大腸桿菌中表達不同來源的氨基酸脫氫酶的基因，檢測其催化活性，及對輔酶NADH、NADPH的特異性進行檢測發現，來源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脫氫酶(其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)，來源于Tistrella mobilis的天冬氨酸半醛脫氫酶(其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示)，來源于Mycobacterium tuberculosis的二氫吡啶二羧酸還原酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)，來源于Tepidanaerobacter acetatoxydans的二氨基庚二酸脫氫酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)可以利用NADH催化上述四步反應。

因此，本發明提供了NADH依賴性的氨基酸脫氫酶，所述氨基酸脫氫酶為：

來源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脫氫酶；

來源于Tistrella mobilis的天冬氨酸半醛脫氫酶；

來源于Mycobacterium tuberculosis的二氫吡啶二羧酸還原酶；和/或來源于Tepidanaerobacter acetatoxydans的二氨基庚二酸脫氫酶；

其氨基酸序列分別如SEQ ID NO.1、3、5、7所示或如SEQ ID No.1、3、5、7所示氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸而不影響其生物活性的氨基酸序列。

經過密碼子優化，本發明提供了編碼上述述NADH依賴性的氨基酸脫氫酶的基因，其核苷酸序列分別含有如SEQ ID NO.2、4、6、8所示的核苷酸序列或SEQ ID No.2、4、6、8所示核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個堿基的具有90％以上同源性的、編碼相同功能氨基酸脫氫酶的核苷酸序列。