[發(fā)明專利]一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導蒲公英產(chǎn)生毛狀根的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811089199.4
• 申請日: 2018-09-18
• 公開（公告）號: CN109182374A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發(fā)明（設計）人: 徐小博;徐萍;莊靜靜;金振銳;王利平;牛嬌嬌;王選年;任敏;趙天宇
• 申請（專利權）人: 新鄉(xiāng)學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06;A01H6/14
• 代理公司: 北京慕達星云知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發(fā)明公開了一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導蒲公英產(chǎn)生毛狀根的方法，該方法包括如下步驟：外植體的制備、發(fā)根農(nóng)桿菌的活化、發(fā)根農(nóng)桿菌浸染及共培養(yǎng)、毛狀根除菌和繼代培養(yǎng)。本發(fā)明經(jīng)過繼代培養(yǎng)最終成功誘導蒲公英產(chǎn)生毛狀根，其具有更強的產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的潛能。采用本發(fā)明進行毛狀根誘導所獲得的毛狀根具有生長速度快、遺傳穩(wěn)定性好的優(yōu)點。本發(fā)明不僅操作簡單、便捷，而且誘導率高，具有大規(guī)模生產(chǎn)工業(yè)用蒲公英藥用成分的替代資源的潛力。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其涉及一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導產(chǎn)生蒲公英毛狀根的方法，并初步建立了蒲公英毛狀根離體培養(yǎng)體系。

背景技術

發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobaeterium rhizogenes)是根瘤菌科(Rhi—zobiaceae)農(nóng)桿菌屬(Agrobactefium)一類革蘭氏陰性土壤農(nóng)桿菌，可以侵染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物，通過發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物，將其所含的Ri質(zhì)粒上的一段DNA(T-DNA)轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中，誘導產(chǎn)生毛狀根。

蒲公英作為一種食藥同源植物，是一種具有廣闊開發(fā)及應用前景的植物資源。我國學者以及臨床醫(yī)學工作者已經(jīng)證實蒲公英具有抗氧化、抑菌、降血脂、降血糖、保肝利膽、胃黏膜損傷修復等作用。

近年來國內(nèi)外對蒲公英的抗氧化及醫(yī)學療效的研究日益活躍，其在此領域的應用價值引起了越來越多人的關注。利用生物反應器進行蒲公英的工程化生產(chǎn)將成為今后的發(fā)展趨勢。目前國內(nèi)外尚未見轉(zhuǎn)化蒲公英發(fā)根成功的報道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中存在的問題，提供一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導蒲公英產(chǎn)生毛狀根的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：

一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導蒲公英產(chǎn)生毛狀根的方法，所述方法具體包括如下步驟：

步驟一、外植體的制備

蒲公英種子用溫水浸泡，選取飽滿的蒲公英種子置于容器中，經(jīng)消毒、沖洗并用無菌紙吸干種子表面殘留水分后，將蒲公英種子轉(zhuǎn)接到1/2MS固體培養(yǎng)基上，于溫度21℃～23℃、光周期為8h～16h的人工氣候箱培養(yǎng)30～35d，待無菌苗長至一定高度時，采取蒲公英外植體進行侵染實驗；

步驟二、發(fā)根農(nóng)桿菌的活化

將低溫保存的發(fā)根農(nóng)桿菌R1601取出，接種菌液于LB固體培養(yǎng)基內(nèi)，在25℃～30℃的條件下培養(yǎng)2～3d長出單菌落后，在無菌操作的前提下挑取單菌落，并將其轉(zhuǎn)入含LB液體培養(yǎng)基的離心管中，于溫度為25℃～30℃、轉(zhuǎn)速為150～200r/min的搖床培養(yǎng)18～20h，培養(yǎng)至菌液變渾濁，然后將菌液和LB液體培養(yǎng)基按體積比1:1的比例轉(zhuǎn)入新的離心管中，于溫度為25℃～30℃、轉(zhuǎn)速為150～200r/min的條件下進行二次活化；待培養(yǎng)18～20h至菌液變渾濁后，吸取活化過兩次的菌液并按照菌液：LB液體培養(yǎng)基＝1:100的比例進行溫度為25℃～30℃、轉(zhuǎn)速為150～200r/min的搖床擴大培養(yǎng)，直至測定菌液OD₆₀₀達到0.5～0.8，用低速冷凍離心機以3000r/min的條件下離心20min，并用MS液體培養(yǎng)基洗滌2～3次，分別重懸至OD₆₀₀＝0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，所得菌懸液備用；

步驟三、發(fā)根農(nóng)桿菌浸染及共培養(yǎng)

(1)外植體的預培養(yǎng)

用剪刀將由步驟一獲得的蒲公英無菌苗的葉片根切斷后用無菌鑷子取出，放置在提前滅過菌的含有無菌吸水紙的平皿中；然后用剪刀或無菌手術刀將葉片的邊緣剪出傷口，并將其剪成0.4～0.6cm²的小塊，將根剪成0.8～1.2cm長；最后將處理過的外植體接種在含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～3d，完成外植體的預培養(yǎng)階段；

(2)菌液共培養(yǎng)