[發明專利]一種利用發根農桿菌誘導蒲公英產生毛狀根的方法

在審

• 申請號: 201811089199.4
• 申請日: 2018-09-18
• 公開（公告）號: CN109182374A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 徐小博;徐萍;莊靜靜;金振銳;王利平;牛嬌嬌;王選年;任敏;趙天宇
• 申請（專利權）人: 新鄉學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06;A01H6/14
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

1.一種利用發根農桿菌誘導蒲公英產生毛狀根的方法，其特征在于，所述方法具體包括如下步驟：

步驟一、外植體的制備

蒲公英種子用溫水浸泡，選取飽滿的蒲公英種子置于容器中，經消毒、沖洗并用無菌紙吸干種子表面殘留水分后，將蒲公英種子轉接到1/2MS固體培養基上，于溫度21℃～23℃、光周期為8h～16h的人工氣候箱培養30～35d，待無菌苗長至一定高度時，采取蒲公英外植體進行侵染實驗；

步驟二、發根農桿菌的活化

將低溫保存的發根農桿菌R1601取出，接種菌液于LB固體培養基內，在25℃～30℃的條件下培養2～3d長出單菌落后，在無菌操作的前提下挑取單菌落，并將其轉入含LB液體培養基的離心管中，于溫度為25℃～30℃、轉速為150～200r/min的搖床培養18～20h，培養至菌液變渾濁，然后將菌液和LB液體培養基按體積比1:1的比例轉入新的離心管中，于溫度為25℃～30℃、轉速為150～200r/min的條件下進行二次活化；待培養18～20h至菌液變渾濁后，吸取活化過兩次的菌液并按照菌液：LB液體培養基＝1:100的比例進行溫度為25℃～30℃、轉速為150～200r/min的搖床擴大培養，直至測定菌液OD₆₀₀達到0.5～0.8，用低速冷凍離心機以3000r/min的條件下離心20min，并用MS液體培養基洗滌2～3次，分別重懸至OD₆₀₀＝0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，所得菌懸液備用；

步驟三、發根農桿菌浸染及共培養

(1)外植體的預培養

用剪刀將由步驟一獲得的蒲公英無菌苗的葉片根切斷后用無菌鑷子取出，放置在提前滅過菌的含有無菌吸水紙的平皿中；然后用剪刀或無菌手術刀將葉片的邊緣剪出傷口，并將其剪成0.4～0.6cm²的小塊，將根剪成0.8～1.2cm長；最后將處理過的外植體接種在含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固體培養基上培養1～3d，完成外植體的預培養階段；

(2)菌液共培養

取出預培養后的外植體，放置于經步驟二活化的菌液中，期間不停震蕩，浸染2～15min，后將浸染后的外植體取出，并用吸水紙吸干表面殘余的菌液，接種到含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固體培養基上置于人工氣候箱中培養1～3d；

(3)除菌培養

在無菌條件下，將完成共培養的外植體轉移至含有100～300mg/L頭孢噻肟鈉的1/2MS固體培養基中于人工氣候箱中培養，每隔3～5d轉接一次，并將頭孢噻肟鈉的濃度降低，且每次轉接時用無菌水沖洗外植體5～10次，并用吸水紙吸干表面殘存的水分，直至培養到在不含頭孢噻肟鈉的培養基中培養，且沒有菌落生成；

步驟四、毛狀根除菌

在步驟三除菌培養中的外植體毛狀根長至3～5cm，剪取毛狀根，置于含有100～300mg/L頭孢噻肟鈉的1/2MS固體培養基中進行繼代培養，直至完全除去農桿菌；

步驟五、繼代培養

將步驟四除菌后的根放于含有1/2MS液體培養基上進行轉代培養，黑暗中，24℃～26℃培養，即完成本發明所述的利用發根農桿菌誘導蒲公英產生毛狀根。

2.根據權利要求1所述的一種利用發根農桿菌誘導蒲公英產生毛狀根的方法，其特征在于，步驟二中，在擴大培養過程中，按照Rif：LB培養基1:1000的比例，向所述LB液體培養基中添加利福平。

3.根據權利要求2所述的一種利用發根農桿菌誘導蒲公英產生毛狀根的方法，其特征在于，所述利福平由以下方法獲得：將提前稱量好的利福平用甲醇溶解，加雙蒸水定容配制成50mg/mL的高濃度母液，濾膜過濾，1.5mL離心管分裝，并于-20℃下冷藏備用。

4.根據權利要求1所述的一種利用發根農桿菌誘導蒲公英產生毛狀根的方法，其特征在于，所述乙酰丁香酮由以下方法獲得：將提前稱量好的乙酰丁香酮用二甲基亞砜和雙蒸水1:1溶解，配制成100μmol/mL的高濃度母液，濾膜過濾，1.5mL離心管分裝，并于-20℃下冷藏備用。