[發明專利]一種提高青花菜離體再生效率的組織培養方法

有效

• 申請號: 201811088523.0
• 申請日: 2018-09-18
• 公開（公告）號: CN109169278B
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發明（設計）人: 曾愛松;李家慶;嚴繼勇;宋立曉;許園園
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 丁靜靜;肖明芳

本發明公開了一種提高青花菜離體再生效率的組織培養方法，該方法選取青花菜花球成熟期的外葉作為外植體，消毒滅菌后切成小塊接種到誘導培養基上，使用紅白組合光(白光：紅光＝3:1)光照處理；將誘導出的不定芽轉接在增殖培養基上進行繼代增殖；取幼苗轉接到生根培養基上誘導生根，獲得生根苗。本發明根據外植體特點，通過培養基不同激素配比、光照處理建立了青花菜高效的再生體系，該方法具有取材便宜、不定芽誘導快、繁殖效率高等優點。

技術領域

本發明涉及一種以青花菜花球成熟期的外葉為外植體，建立高效的離體再生技術體系的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

青花菜，別名綠菜花、西蘭花、莖椰菜、意大利芥藍，屬十字花科蕓薹屬甘藍類蔬菜，以其主莖和側枝頂端形成的花球供食用。青花菜富含多種維生素和礦物質，尤其含有豐富的防癌和抗癌物質萊菔硫烷（sulforaphane，SF 或 SFN）。近年來，青花菜種植面積在我國迅速擴大，成為我國重要的出口蔬菜。但是目前生產上使用主栽品種的約90%皆為進口品種，種質資源匱乏是限制我國青花菜品種選育的關鍵問題之一。

目前生產上的商品種基本上為雄性不育系配制的雜交種，在找到較好的保持系或恢復系之前，對其進行離體保存是種質資源保存的必需環節。國內外對于青花菜的離體保存，其中利用花蕾、花器官、葉片、帶柄子葉及腋芽作為外植體進行組織培養研究均有過報道，但不同基因型、不同外植體間的再生頻率差異很大。其中利用葉片作為外植體的研究中所用葉片系取自植株的腋芽所發生的葉子,但又因多數品種不發生腋芽或腋芽較少而存在困難（李曙軒和裘文達，1983）。本研究利用青花菜花球成熟期的外葉作為外植體，建立了一種更為簡單、高效、通用的離體再生技術體系，為雄性不育系、自交不親和系，以及接籽困難青花菜材料的無性繁殖和擴繁提供了更適用的方法。

發明內容

本發明以青花菜花球成熟期的外葉作為外植體，根據外植體特點，在現有組織培養中常規技術的基礎上，通過試驗研究，對多個技術環節分別進行單因素和多因素試驗，對再生技術體系進行調整、改良，提出了一套系統的創新體系，達到了一個良好的效果。

本發明的目的可通過以下技術方案實現：

1）外植體選擇

取青花菜花球成熟期的外葉，采用體積分數75%的乙醇對其滅菌1~2 min，然后用體積分數8~9 %的次氯酸鈉消毒15~20 min，最后用無菌水沖洗3~4次。滅菌后，將葉片切成邊長為1.0～1.5 cm的方塊；

2）分化誘導

把外植體接種到MS培養基上，置于溫度為25±0.5 ℃，每天光照時間為14h的培養室中培養，15～20 d可直接誘導出不定芽；

所述誘導培養基為MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+6~7 g/L瓊脂 + 25~30 g蔗糖, pH5.8；

所述光照條件為白光燈：紅光燈=3:1；

3）繼代增殖

將誘導產生的單芽或叢生芽（叢生芽切割成單芽）轉接到繼代增殖培養基上，25~30 d轉接一次，經過3~4次的繼代，芽的倍數可達200倍左右的增殖；期間光照培養環境為：白光，光照時間為14 h/d，培養溫度為25±0.5 ℃；

所述繼代增殖培養基為MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+6~7 g/L瓊脂+25~30 g蔗糖, pH5.8；

4）生根誘導

幼芽生長至3~4 cm高時，將其轉接到生根培養基上，15~20 d可誘導生根，獲得生根苗；期間光照培養環境為：白光，光照時間為14 h/d，培養溫度為25±0.5 ℃；