[發明專利]一種移植用牙髓間充質干細胞微球的制備體系

在審

• 申請號: 201811085961.1
• 申請日: 2018-09-18
• 公開（公告）號: CN109251889A
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 中晶生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/28;A61P1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開一種移植用牙髓間充質干細胞微球的制備體系。該制備體系采用可搖動裝置使細胞置于三維培養環境中，能夠促使牙髓間充質干細胞形成三維立體球狀結構，更好地保持培養細胞的干性，利于其在組織損傷修復的移植中發揮作用。

技術領域

本發明屬于干細胞技術領域，涉及一種牙髓間充質干細胞微球的制備及其移植方法。

背景技術

干細胞是一種具有自我更新能力和多系分化潛能的原始細胞，是細胞移植的理想細胞。在個體發育過程中，存在各種形式的干細胞，如胚胎干細胞，多能干細胞以及各種組織中的定向干細胞如造血干細胞、神經干細胞等。但在實際應用上卻面臨倫理的挑戰或取材的限制。

間充質干細胞（MSC）是存在于人體組織中具有多系分化潛能的一種亞全能干細胞群，因其在特定環境下可誘導分化為多種組織細胞，具有免疫原性低，移植后能形成穩定嵌合等特點，故可作為一種理想的供異體移植的細胞。牙髓間充質干細胞（dental pulp stemcells,DPSCs）是從牙髓組織中分離得到的一類具有高增殖能力、高度自我更新能力、多向分化能力的細胞。2000年首次發現了牙髓間充質干細胞，Gronthos等發現在離體的乳牙和智齒中都存在牙髓間充質干細胞。人類有20顆乳牙，在乳恒牙交替期會逐漸自然脫落，牙髓組織來源非常易得，且無創傷。并且還具有以下優勢：牙髓組織源于自體組織，無免疫排斥反應，能用于組織與器官再生與修復；具有刺激病變組織治愈病變自身；具有免疫調節和抗炎特性；DPSCs能夠在體外穩定增殖且衰亡率低；少量組織即可獲取大量干細胞，適宜大規模培養，對機體損傷小等優點。已有研究利用該細胞成功地構建牙髓、牙本質以及牙齒組織，最新研究表明，牙髓間充質干細胞對于腸道炎癥疾病的治療有明顯的優勢。牙髓間充質干細胞分離、培養技術的完善將推動其進行疾病治療。

目前，臨床實驗采用的牙髓間充質干細胞移植方法為將牙髓間充質干細胞在體外進行培養、擴增后制備成單細胞懸液，然后將單細胞懸液注射至患處，此種方法由于注入的是單細胞懸液，注入到患者體內的單細胞容易分散到身體的其他部位；除此之外，目前還有一種干細胞微球的制備方法，此方法一般為在培養瓶或培養皿的底部鋪一層瓊脂糖凝膠使細胞不能貼壁生長而形成微球體，但是此方法操作繁瑣，且不適合大規模生產。

為克服上述缺點，本發明提供一種能夠更好地保持干細胞生物學特性，且操作簡單、適合大規模生產的牙髓間充質干細胞微球的制備方法并用于移植到患者體內，移植后的細胞微球體不易擴散至身體其他部位，便于臨床操作，在牙髓組織的修復和牙齒組織工程中有廣闊的應用前景，并有可能取代現有的牙齒缺損或缺失的治療方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種移植用牙髓間充質干細胞微球的制備方法。用普通培養方法將牙髓間充質干細胞培養至1-6代，當細胞融合度達到70~90%時進行傳代培養，傳代培養的細胞經洗滌、消化后接種在新的細胞培養瓶或細胞培養皿中，將裝有新傳代細胞的培養瓶或培養皿放入轉速為50~300rpm的牙髓干細胞三維培養裝置中，使放在其上的培養瓶或培養皿能夠恒速搖擺，搖擺培養裝置放入37℃，5% CO2細胞培養箱中。待牙髓間充質干細胞微球直徑達40~200um時，用移液管吸取至離心管中，用離心機以300~800rpm轉速離心2~10min，后用0.1-30毫升0.9%生理鹽水重懸牙髓間充質干細胞微球沉淀，再用0.5-3mm針孔注射器將微球體懸液吸入后，注射到患處。整個發明包含2個步驟：

1）牙髓間充質干細胞微球的制備

上述方法中，所培養的牙髓間充質干細胞代數為第1~6代。

上述方法中，當所培養的牙髓間充質干細胞融合度達到70-90%時進行傳代培養。

上述方法中，傳代培養的細胞經洗滌、消化后以4×10⁴~1×10⁶個的密度接種于新的細胞培養瓶或培養皿中。

上述方法中，將裝有新傳代細胞的培養瓶或培養皿放入干細胞三維培養體系中。