[發明專利]一種利用基因編輯技術獲得高油酸油菜的方法

有效

• 申請號: 201811084234.3
• 申請日: 2018-09-18
• 公開（公告）號: CN109182373B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 萬麗麗;王轉茸;辛強;洪登峰;楊光圣
• 申請（專利權）人: 武漢市農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N9/22;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

本發明公開了一種利用基因編輯技術培育高油酸油菜的方法，具體是利用CRISPR/Cas9系統對FAD2基因進行定點編輯從而得到轉基因油菜植株，具體包括以下步驟：(1)選擇FAD2基因的兩個gRNA的靶位點分別為S1和S2，并合成構建載體相關引物；(2)雙靶點CRISPR/Cas9基因編輯載體的構建；(3)抽提質粒，轉化農桿菌；(4)利用農桿菌介導轉化，將表達載體轉入油菜，篩選獲得FAD2基因發生突變的轉基因植株。所述轉基因油菜植株相比于野生型油菜植株含油量顯著增高。而且本發明提供的方法有比較高的編輯效率，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明涉及植物基因工程領域，具體涉及利用CRISPR/Cas9系統對甘藍型 油菜FAD2基因進行編輯，進而獲得高油酸含量的油菜品種。

背景技術

甘藍型油菜(Brassica napus L.,2n＝38，AACC)為十字花科蕓薹屬植物，是我 國種植面積最大的油料作物。經過長期自然選擇和人工選擇，甘藍型油菜的農藝 性狀也在不斷向更適應人類日常需求的方向進行定向的改良。良好的甘藍型油菜 農藝性狀主要包括高含油量、高不飽和脂肪酸含量、低硫甙、低芥酸、抗逆以及 良好的株型等。其中，具有低芥酸、低硫甙的“雙低”性狀油菜培育是近年來甘藍 型油菜育種的研究熱點。另外，“雙低”油菜的菜籽油中包括了油酸、亞油酸等優 良不飽和脂肪酸的組分，優良品種中油酸含量甚至可以高達80％。品質優良的 甘藍型油菜對國民經濟的增長以及國民生活質量的提升都具有至關重要的作用， 而優良脂肪酸含量的菜籽油對人類心血管健康非常有利。在人體的健康功效方面， 高油酸菜籽油能夠良好的調節人體內脂質代謝，維持心腦血管功能的正常進行， 促進人體內消化吸收，降低人體內膽固醇，甘油三酯等含量，從而進一步控制血 糖含量，對青少年智力發育、人體免疫、骨質形成等方面都有良好的促進作用。 因此，高油酸菜油被認為是與橄欖油、葵花籽油相媲美的高級食用類植物油。因 此，培育高油酸低亞麻酸甘藍型油菜是油菜品質育種工作的重要目標。

前人研究表明抑制脂肪酸脫氫酶(fatty acid desaturase-2，FAD2)基因表達從而 降低種子中脂肪酸脫氫酶的活性，便能抑制油酸向亞油酸轉化，以使種子中的 油酸增加。官春云等通過對甘藍型油菜進行輻射誘變的方法，獲得了油酸含量 高達93.5％的高油酸材料，通過對高油酸材料基因序列與公布的甘藍型油菜基 因組序列進行比對發現，在FAD2基因270bp處出現堿基的替換，從而形成終 止密碼子，使FAD2基因不再具有功能性。陳葦等通過RNAi方法阻礙FAD2 基因的功能，以此得到的材料油酸量高達83.9％。

CRISPR/Cas系統是一種最新基因編輯技術。該技術不僅對基因功能的研究 提供了新思路，更廣泛的應用于生物醫藥的研發和農作物的遺傳改良等領域。隨 著該系統進行一系列特異性改造，被迅速應用到擬南芥、水稻、玉米、小麥等植 物中。CRISPR/Cas9基因編輯技術不僅能夠快速、便捷的實現基因的靶向突變， 更能高效的聚合作物某些優良農藝性狀，為作物育種提供創新高效的新途徑。

經檢索，未發現利用CRISPR/Cas9技術調節甘藍型油菜油酸含量的報道。

發明內容

本發明的目的在于解決現有技術中存在的問題，在甘藍型油菜中初步建立穩 定高效的CRISPR/Cas9體系，通過對甘藍型油菜進行基因定點突變，創建高油 酸油菜新材料。

本發明選擇對目的基因A5FAD2進行定點的突變，所述基因A5FAD2的序 列信息從Darmor-bzh49參考基因組數據庫(Chalhoub et al 2014, http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中提取，用Geneious軟件比對生成。

本發明提供了一種利用基因編輯技術獲得高油酸油菜的方法，具體是利用CRISPR/Cas9系統對A5FAD2基因進行定點編輯從而得到轉基因油菜植株，主 要包括以下步驟：