[發明專利]一種利用基因編輯技術獲得高油酸油菜的方法有效
| 申請號： | 201811084234.3 | 申請日： | 2018-09-18 |
| 公開（公告）號： | CN109182373B | 公開（公告）日： | 2020-10-09 |
| 發明（設計）人： | 萬麗麗;王轉茸;辛強;洪登峰;楊光圣 | 申請（專利權）人： | 武漢市農業科學院 |
| 主分類號： | C12N15/82 | 分類號： | C12N15/82;C12N9/22;A01H5/00;A01H6/20 |
| 代理公司： | 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 42212 | 代理人： | 胡清堂 |
| 地址： | 430076 湖北省武漢*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 利用 基因 編輯 技術 獲得 油酸 油菜 方法 | ||
1.一種利用基因編輯技術獲得高油酸油菜的方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9系統對FAD2基因進行定點編輯從而得到編輯后的油菜植株，具體包括以下步驟：
步驟S1、選擇FAD2基因的兩個gRNA的靶位點分別為S1和S2，并合成構建載體相關引物；
步驟S2、雙靶點CRISPR/Cas9基因編輯載體的構建；
步驟S3、抽提質粒，轉化農桿菌；
步驟S4、利用農桿菌介導轉化油菜，篩選獲得FAD2基因發生突變的轉基因植株；
所述步驟S1中，靶位點S1序列為SEQ ID No.1，靶位點S2序列為SEQ ID No.2。
2.根據權利要求1所述的利用基因編輯技術獲得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述油菜為甘藍型油菜。
3.根據權利要求1所述的利用基因編輯技術獲得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述步驟S1中引物序列分別為SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6。
4.根據權利要求1所述的利用基因編輯技術獲得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述步驟S2中雙靶點CRISPR/Cas9基因編輯載體的構建過程如下：
步驟S21、gRNA表達盒組裝：用高保真酶以稀釋100倍的pCBC-DT1T2質粒為模板進行PCR擴增并純化回收PCR產物；
步驟S22、靶點與載體組裝：用BsaI單酶切以及T4連接酶對步驟S21中的擴增產物與CRISPR/Cas9載體組裝最終載體；
步驟S22、轉化大腸桿菌感受態，Kan板篩選，菌落PCR鑒定。
5.根據權利要求1所述的利用基因編輯技術獲得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述步驟S3中轉化后的農桿菌，含有Cas9和靶位點。
6.根據權利要求1所述的利用基因編輯技術獲得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述步驟S4中農桿菌介導轉化的部位為油菜下胚軸。
7.根據權利要求1、5或6所述的利用基因編輯技術獲得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述農桿菌類型為GV3101。
8.根據權利要求1所述利用基因編輯技術獲得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述基因編輯位點為FAD2基因A5位點。
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