[發明專利]一種高通量選育石油降解突變株的方法

在審

• 申請號: 201811079881.5
• 申請日: 2018-09-17
• 公開（公告）號: CN109182183A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 鐘成;劉正;田亞東;賈士儒;謝燕燕
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種高通量選育石油降解突變株的方法，采用Licl?ARTP復合誘變戈登氏菌株，提高菌株的石油烴降解能力。包括以下步驟：(1)菌懸液的制備(2)含不同濃度氯化鋰的TSB固體培養基配制(3)對菌株分別進行單一化學誘變(Licl)和常溫室壓等離子體誘變(ARTP)，計算致死率并分別測定單一誘變菌株的石油烴降解率。(4)對菌株進行Licl?ARTP復合誘變。(5)以96孔板發酵法代替搖瓶發酵法，采用紫外分光光度法高通量篩選誘變菌株。所述菌株為戈登氏菌。本方法誘變菌株正突變率高、石油烴降解能力明顯提高。有利于工業應用，在經濟、環境和社會效益方面都有重大意義。

技術領域

本發明屬于微生物菌種的誘變選育技術領域，涉及使用一種高通量選育石油降解突變株的方法，依據此方法可以選育獲得高石油烴降解率的石油烴降解菌株。

背景技術

石油是一種含有多種烴類(正烷烴、直鏈烷烴、芳烴、脂環烴)及少量其他有機物(硫化物、氮化物、環烷酸類)的復雜化合物。石油含有多種有害物質，其中苯系物BTEX(苯、甲苯、乙苯和二甲苯)和多環芳烴PAHs(菲、蒽、芘等)，具有顯著的“三致”(致癌變、致突變、致畸)效應，采取有效措施進行驅油治理勢在必行。采用戈登氏菌株降解石油是一種有效的方法，但目前主要問題是由于其降解效率低而導致降解成本高，變異頻譜窄，變異率低，操作較復雜。

化學誘變是用化學誘變劑誘發菌種遺傳物質的突變，引起形態特征的變異，經鑒定、培育后，最終育成新品種。氯化鋰作為一種高效、低毒的化學誘變劑，經常被用作誘變育種。氯化鋰誘變可導致AT-GC堿基對的轉換或導致堿基的缺失。

常溫室壓等離子體誘變(ARTP)是近年來新興的一種高效率誘變技術，以高純氦氣為工作氣體，利用射頻輝光放電原理，在常溫常壓狀態下產生高能量的等離子體，其富含的高能化學活性粒子能夠對菌株細胞產生高強度遺傳物質損失，進而利用細胞啟動的SOS高容錯率修復機制，產生種類多樣的錯配位點，最終形成了遺傳穩定、種類豐富的突變株。具有操作簡便、條件溫和、不需要真空條件、安全性高、誘變快速、突變率高等特點，可以大大提高菌種突變的強度和突變庫容量提高菌株的變異幾率。

復合誘變包括兩種或多種誘變劑的先后使用、同一種誘變劑的重復使用和兩種或多種誘變劑的同時使用。復合誘變具有協同效應，普遍認為兩種或兩種以上誘變劑合理搭配進行復合誘變較單一誘變效果好。

紫外分光光度法測量石油烴降解率主要是根據石油及石油制品中的芳香族有機物及其他一些具有共軛雙鍵有機物的紫外區能吸收光譜的特點，對石油類物質的含量進行測定測定范圍為215-260nm。

現階段主要研究提高菌株石油烴降解能力的方法，主要以單一誘變方法為主。專利公開號CN 101041811A公布了一種通過紫外誘變，馴化篩選石油烴降解菌株，該發明雖然提高了菌株的石油烴降解能力，但是負突變率高，篩選效率低。專利公開號CN 103333881A公布了一種通過離子輻射誘變菌株，提高石油烴降解能力的方法。此方法適應性強，穩定性好，但是菌株的石油烴降解能力提升不顯著。本發明能明顯提高菌株正突變率，96孔板高通量篩選大幅提高菌株篩選效率。

發明內容

為了解決上述現有技術問題，本發明的目的在于提供一種操作方便、高突變率、篩選效率高的復合誘變菌株新方法。采用該方法選育的菌株石油烴降解能力有較大程度提高，進而提高菌株降解效率，降低成本，社會和經濟效益明顯。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：一種高通量選育石油降解突變株的方法。其特別之處在于：分別確定使戈登氏菌株致死率為70-80％左右的氯化鋰濃度和ARTP誘變時間。將菌懸液通過ARTP誘變系統誘變適宜時間后，涂布于含適宜濃度氯化鋰的TSB固體培養基中進行二次誘變。挑選復合誘變菌株轉接至含油培養基的深96孔板中，結合紫外分光光度法高通量選育誘變菌株。具體步驟如下：