[發明專利]AURKA-CKO1-N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法

有效

• 申請號: 201811079721.0
• 申請日: 2018-09-14
• 公開（公告）號: CN109197781B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 楊晶;鄭葵陽;湯仁仙
• 申請（專利權）人: 徐州醫科大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 北京細軟智谷知識產權代理有限責任公司 11471
• 代理人: 韓國強

1.一種AURKA-CKO1-N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)構建AURKA條件性基因敲除的重組打靶載體；

(2)所述重組打靶載體經線性化后，轉染胚胎干細胞；

(3)篩選發生同源重組的胚胎干細胞克??；

(4)將篩選出的發生同源重組的陽性胚胎干細胞克隆經擴增后，注入供體小鼠的囊胚；

(5)將含有陽性胚胎干細胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宮，生產出嵌合體小鼠；

(6)嵌合體小鼠與flp小鼠交配獲得陽性F1代去Neo雜合子小鼠；

(7)陽性F1代去Neo雜合子小鼠與組織特異性表達Cre重組酶的小鼠交配后，獲得雙雜合的小鼠；

(8)雌性與雄性雙雜合小鼠互交，后代中獲得具有AURKA-CKO1-N條件性基因敲除的小鼠模型；

采用Infusion方法構建所述重組打靶載體，具體操作如下：

使用細菌人工染色體BAC打靶，將2個loxP位點分別插入到內含子2和內含子3，當Cre表達時敲除小鼠AURKA基因第3號外顯子，并用Neo基因替換、造成移碼突變，使蛋白翻譯提前終止在第3號外顯子；

上游臂4.2kb，下游臂4.0kb，下游臂側翼接磷酸甘油酸激酶啟動子介導的單純皰疹病毒胸苷激酶負篩選標記基因基因表達框，最終得到AURKA-CKO同源重組打靶載體；

所述重組打靶載體包含4.2kb5’同源臂、0.6kb兩側引入重組酶Loxp位點區域、磷酸甘油酸激酶新霉素抗性正篩選標記基因、4.0kb3’同源臂和單純皰疹病毒胸苷激酶負篩選標記基因。

2.根據權利要求1所述的AURKA-CKO1-N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法，其特征在于，所述重組打靶載體進行線性化的具體操作為：

100μgAURKA-CKO同源重組打靶載體用酶用量300IU的NotI線性化，酶切體系為250μL，37℃消化過夜；之后用等體積的苯酚-三氯甲烷和三氯甲烷處理，無水乙醇沉淀，100μL無菌PBS重懸。

3.根據權利要求1所述的AURKA-CKO1-N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法，其特征在于，所述轉染為電轉染。

4.根據權利要求3所述的AURKA-CKO1-N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法，其特征在于，所述電轉染的具體操作為：

ES細胞用胰酶消化后重懸于PBS中，取35μg載體DNA與0.8ml細胞混勻后加入電穿孔槽中，將電擊后的細胞分入已鋪好滋養層細胞的培養皿中，置于CO₂孵箱培養。

5.根據權利要求1所述的AURKA-CKO1-N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法，其特征在于，步驟(2)中，篩選發生同源重組的胚胎干細胞克隆的具體操作為：

ES細胞在電穿孔24h和48h后分別換含有250mg/L選擇藥物G418和2μMGancyclovir培養液進行選擇性培養，第7-8天挑取ES細胞克隆的基因組DNA，進行跨5’臂或3’臂和插入片段的長鏈PCR鑒定。

6.根據權利要求5所述的AURKA-CKO1-N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法，其特征在于，PCR鑒定時，5’臂的引物序列分別為P1：5’-GCAGGTCCTACTGGCAGATG-3’，P2：5’-CGTGCCTCTCCTTTCTGGAG-3’，目的片段為4.6kb，PCR反應條件為：95℃3min，98℃15s，61℃15s，68℃3min，68℃5min，共32個循環。

7.根據權利要求5所述的AURKA-CKO1-N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法，其特征在于，PCR鑒定時，3’臂的引物序列分別為P3：5’-AAGCTTGATATCGAATTCCGAA-3’，P4：5’-GCACTCGCAAGAAAAGGGTG-3’，目的片段為6.1kb，PCR反應條件為：95℃3min，98℃15s，61℃15s，68℃3min，68℃5min，共32個循環。

8.根據權利要求1所述的AURKA-CKO1-N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法，其特征在于，所述供體小鼠為C57BL/6供體小鼠。