[發明專利]AURKA-CKO1-N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法

有效

• 申請號: 201811079721.0
• 申請日: 2018-09-14
• 公開（公告）號: CN109197781B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 楊晶;鄭葵陽;湯仁仙
• 申請（專利權）人: 徐州醫科大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 北京細軟智谷知識產權代理有限責任公司 11471
• 代理人: 韓國強

本發明涉及一種AURKA?CKO1?N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法，通過先構建重組打靶載體，線性化后轉染胚胎干細胞，篩選發生同源重組的胚胎干細胞克隆，擴增后注入供體小鼠囊胚生產出嵌合體小鼠；嵌合體小鼠與flp小鼠交配獲得陽性F1代小鼠；陽性F1代小鼠與組織特異性表達Cre重組酶的小鼠交配后，后代中獲得具有AURKA?CKO1?N條件性基因敲除的小鼠模型。本發明所述的AURKA?CKO1?N條件性基因敲除小鼠模型，AURKA基因在特定組織和細胞類型中功能性缺失，為研究Aurora?A在特定腫瘤發生發展中的作用機制提供理想模型。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種AURKA-CKO1-N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法。

背景技術

基因敲除是80年代后半期應用DNA同源重組原理發展起來的一門新技術。基因敲除的定義是指對一個結構已知但功能未知的基因，從分子水平上設計實驗，將該基因去除，然后從整體觀察實驗動物，推測相應基因的功能。

Aurora-A是參與調控細胞有絲分裂的一類重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其編碼基因定位于易位、缺失、擴增活躍的20q13.2染色體區域。意味著其表達模式具有天然的不穩定性。Aurora-A異常表達會引起細胞有絲分裂異常，進而導致基因組不穩定而誘發腫瘤形成。越來越多的研究顯示，Aurora-A在結直腸癌、神經膠質瘤、乳腺癌、胰腺癌中異常高表達；此外，該區域擴增也被認為與患者預后不良有關。然而，Aurora-A參與腫瘤發生、發展的機制有待進一步闡明。然而，由于Aurora-A全身敲除小鼠容易造成小鼠胚胎致死。因此，構建條件性基因敲除小鼠模型為研究Aurora-A在腫瘤形成中的作用至關重要。

發明內容

為了解決現有技術存在的上述問題，本發明提供了一種AURKA-CKO1-N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法。本發明的構建方法，通過利用Aurka基因flox小鼠與組織特異性表達Cre重組酶的小鼠交配后，其后代flox純合、Cre陽性小鼠的flox區域被敲除，導致Aurka基因在特定組織和細胞類型中功能性缺失，為有目的的研究Aurora-A在特定腫瘤發生發展中的作用機制提供理想的模型。

本發明所采用的技術方案為：

一種AURKA-CKO1-N條件性基因敲除小鼠模型的構建方法，包括如下步驟：

(1)構建AURKA條件性基因敲除的重組打靶載體；

(2)所述重組打靶載體經線性化后，轉染胚胎干細胞；

(3)篩選發生同源重組的胚胎干細胞克隆；

(4)將篩選出的發生同源重組的陽性胚胎干細胞克隆經擴增后，注入供體小鼠的囊胚；

(5)將含有陽性胚胎干細胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宮，生產出嵌合體小鼠；

(6)嵌合體小鼠與flp小鼠交配獲得陽性F1代去Neo雜合子小鼠；

(7)陽性F1代去Neo雜合子小鼠與組織特異性表達Cre重組酶的小鼠交配后，獲得雙雜合的小鼠；

(8)雌性與雄性雙雜合小鼠互交，后代中獲得具有AURKA-CKO1-N條件性基因敲除的小鼠模型。

采用Infusion方法構建所述重組打靶載體，具體操作如下：

使用細菌人工染色體BAC打靶，使2個loxP位點分別插入到內含子2和內含子3，當Cre表達時可敲除小鼠AURKA基因第3號外顯子，并用Neo基因替換、造成移碼突變，使蛋白翻譯提前終止在第3號外顯子；

上游臂4.2kb(DNA千堿基對)，下游臂4.0kb，下游臂側翼接磷酸甘油酸激酶啟動子介導的單純皰疹病毒胸苷激酶負篩選基因基因表達框，最終得到AURKA-CKO同源重組打靶載體。