[發(fā)明專利]高效準(zhǔn)確超靈敏檢測(cè)乳腺細(xì)胞癌變的檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811078847.6
• 申請(qǐng)日: 2018-09-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109142197A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐艇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇瑞明生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N15/10
• 分類號(hào): G01N15/10;G01N33/50
• 代理公司: 上海海頌知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31258
• 代理人: 任益;閆玉芳

本發(fā)明公開(kāi)了一種高效準(zhǔn)確檢測(cè)乳腺細(xì)胞癌變的檢測(cè)方法，包括步驟1，試驗(yàn)用細(xì)胞株進(jìn)行消化吹打處理形成細(xì)胞懸液；步驟2，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定細(xì)胞懸液中的細(xì)胞密度；步驟3，用PBS緩沖液沖洗粘附在蓋玻片上的細(xì)胞3次；步驟4，將細(xì)胞浴槽放入納米光電生化檢測(cè)儀記錄細(xì)胞內(nèi)DCF（特異性熒光染料）的熒光光子數(shù)響應(yīng)。本發(fā)明實(shí)時(shí)檢測(cè)揭示了在癌細(xì)胞中比正常細(xì)胞有明顯更高的氧化響應(yīng)，為在納米級(jí)的環(huán)境中探測(cè)化學(xué)動(dòng)力學(xué)以闡明關(guān)鍵生物過(guò)程提供了一個(gè)獨(dú)特的應(yīng)用方向。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種乳腺細(xì)胞癌變的檢測(cè)方法，屬于生物活性細(xì)胞檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

復(fù)雜的細(xì)胞活動(dòng)，如DNA修復(fù)，氧化活性，細(xì)胞程序性死亡和轉(zhuǎn)錄調(diào)控通常是由多個(gè)相互關(guān)聯(lián)的錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)通路控制。生物學(xué)的傳統(tǒng)工作集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的單一成分的研究。雖然這些研究都在發(fā)現(xiàn)各種信號(hào)成分上取得顯著的進(jìn)步，但是復(fù)雜的細(xì)胞過(guò)程和他們的調(diào)控的充分瓦解要求在時(shí)間和空間上多個(gè)相關(guān)參數(shù)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。作為一個(gè)重要的細(xì)胞過(guò)程，氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持依賴于活性氧(ROS)的產(chǎn)生和消除系統(tǒng)的相互作用。這種系統(tǒng)的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，造成生物學(xué)上的破壞，并且牽涉到各種病理情況，包括癌癥，心血管疾病，炎癥和退行性疾病。

《生物傳感器與生物電子學(xué)》于2011年發(fā)表了一篇論文：雙功能電光納米探針實(shí)時(shí)檢測(cè)單細(xì)胞中局部的生物化學(xué)過(guò)程(Biosensors and Bioelectronics 26(2011)4484–4490)。該文章提供了一種高效準(zhǔn)確檢測(cè)乳腺細(xì)胞癌變的檢測(cè)方法，該方法通過(guò)添加刺激物能夠?qū)崟r(shí)地得到不同的單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)原位的DCF熒光光子數(shù)響應(yīng)。但是該方法對(duì)H2O2的反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，能夠檢測(cè)的H2O2釋放的總量較低，無(wú)法檢測(cè)超低量的H2O2；但乳腺癌早期時(shí)H2O2的濃度極低，因此該方法不適用于早期乳腺癌的檢測(cè)。另一方面早期癌癥的檢測(cè)或篩選對(duì)病人的早期治療具有極為重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種高效準(zhǔn)確超靈敏檢測(cè)乳腺細(xì)胞癌變的檢測(cè)方法，該方法通過(guò)添加刺激物能夠?qū)崟r(shí)地得到不同的單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)原位的DCF熒光光子數(shù)響應(yīng)。

說(shuō)明：人正常乳腺上皮細(xì)胞株：英文縮寫-MCF10A；人乳腺癌細(xì)胞株：英文縮寫-MCF7；人皮表生長(zhǎng)因子受體-2：英文縮寫-HER2，人皮表生長(zhǎng)因子受體-2過(guò)表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株：英文縮寫-MCF7/HER2。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:

一種高效準(zhǔn)確超靈敏檢測(cè)乳腺細(xì)胞癌變的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

步驟1，選擇人乳腺上皮細(xì)胞株MCF10A、人乳腺癌細(xì)胞株MCF7、HER2過(guò)表達(dá)的MCF7細(xì)胞株(MCF7/HER2)作為試驗(yàn)用細(xì)胞株，并對(duì)試驗(yàn)用細(xì)胞株進(jìn)行消化吹打處理形成細(xì)胞懸液；

步驟2，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定細(xì)胞懸液中的細(xì)胞密度，以細(xì)胞密度為1×10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²接種到細(xì)胞浴槽的蓋玻片上用于細(xì)胞附著；

步驟3，細(xì)胞分別附著24h、24.5h、25h、25.5h后，用PBS緩沖液沖洗粘附在蓋玻片上的細(xì)胞3次，在37℃用染料DCFH-DA染色細(xì)胞30分鐘，孵育后，將染色的細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗三次后向細(xì)胞浴槽中加入100μl的PBS緩沖液；

步驟4，將細(xì)胞浴槽放入納米光電生化檢測(cè)儀，調(diào)整納米探頭與細(xì)胞的相對(duì)位置，檢測(cè)過(guò)程中添加刺激物PMA并同時(shí)記錄細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光光子數(shù)響應(yīng)。

其中，步驟1中，先將試驗(yàn)用細(xì)胞株用PBS緩沖液清洗，清洗后用0.25％的胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，細(xì)胞消化后用含血清(血清的質(zhì)量百分濃度為10％)的新鮮培養(yǎng)基終止消化，將混懸液吸到離心管中，1000r/min離心5min，得到的沉淀物用含血清的培養(yǎng)基重懸吹勻即可。

其中，步驟2中，所述細(xì)胞浴槽的蓋玻片為細(xì)胞可爬壁生長(zhǎng)的蓋玻片。