[發明專利]高效準確超靈敏檢測乳腺細胞癌變的檢測方法

在審

• 申請號: 201811078847.6
• 申請日: 2018-09-17
• 公開（公告）號: CN109142197A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發明（設計）人: 徐艇
• 申請（專利權）人: 江蘇瑞明生物科技有限公司
• 主分類號: G01N15/10
• 分類號: G01N15/10;G01N33/50
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙) 31258
• 代理人: 任益;閆玉芳

1.一種高效準確超靈敏檢測乳腺細胞癌變的檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟1，選擇人乳腺上皮細胞株（MCF10A）、人乳腺癌細胞株（MCF7）、HER2過表達的MCF7細胞株（MCF7/HER2）作為試驗用細胞株，并對試驗用細胞株進行消化吹打處理形成細胞懸液；

步驟2，用血球計數板測定細胞懸液中的細胞密度，以細胞密度為1×10⁴個細胞/cm²接種到細胞浴槽的蓋玻片上用于細胞附著；

步驟3，細胞分別附著24h、24.5h、25h、25.5h后，用PBS緩沖液沖洗粘附在蓋玻片上的細胞3次，在37℃ 用染料DCFH-DA染色細胞30分鐘，孵育后，將染色的細胞用PBS緩沖液沖洗三次后向細胞浴槽中加入100μl的PBS緩沖液；

步驟4，將細胞浴槽放入納米光電生化檢測儀，調整納米探頭與細胞的相對位置，檢測過程中添加刺激物PMA并同時記錄細胞內DCF的熒光光子數響應。

2.根據權利要求1所述的高效準確超靈敏檢測乳腺細胞癌變的檢測方法，其特征在于：步驟1中，先將試驗用細胞株用PBS緩沖液清洗，清洗后用0.25%的胰蛋白酶溶液消化細胞，細胞消化后用含血清的培養基終止消化，將混懸液吸到離心管中，1000r/min離心5min，得到的沉淀物用含血清的培養基重懸吹勻即可。

3.根據權利要求1所述的高效準確超靈敏檢測乳腺細胞癌變的檢測方法，其特征在于：步驟2中，所述細胞浴槽的蓋玻片為細胞可爬壁生長的蓋玻片。

4.根據權利要求1所述的高效準確超靈敏檢測乳腺細胞癌變的檢測方法，其特征在于：步驟3中，所述染料DCFH-DA的濃度分別為20μM、25μM、30μM、 35μM。

5.根據權利要求1所述的高效準確超靈敏檢測乳腺細胞癌變的檢測方法，其特征在于：步驟3中，所述染料DCFH-DA的激發波長為485nm，發射波長為530nm。

6.根據權利要求1所述的高效準確超靈敏檢測乳腺細胞癌變的檢測方法，其特征在于：步驟4中，所述納米探頭是尖端通光，尖端尺寸在100nm左右的鍍膜納米探頭。

7.根據權利要求1所述的高效準確超靈敏檢測乳腺細胞癌變的檢測方法，其特征在于：步驟4中，所述納米探頭通過微操作系統進行控制移動。

8.根據權利要求1所述的高效準確超靈敏檢測乳腺細胞癌變的檢測方法，其特征在于：步驟4中，所述納米探頭與細胞的相對位置通過倒置熒光生物顯微鏡進行觀察調整。

9.根據權利要求1所述的高效準確超靈敏檢測乳腺細胞癌變的檢測方法，其特征在于：步驟4中，所述檢測熒光光子響應過程中添加刺激物PMA的濃度分別為10μM、 15μM, 20μM、25μM。