[發(fā)明專(zhuān)利]一種巢式PCR檢測(cè)或/和鑒定布魯氏菌的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811075543.4
• 申請(qǐng)日: 2018-09-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109306372A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田國(guó)忠;姜海;樸東日;趙鴻雁;楊曉雯
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6848
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6848;C12Q1/04;G16B40/00;C12R1/01
• 代理公司: 北京思海天達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11203
• 代理人: 張立改

一種巢式PCR檢測(cè)或/和鑒定布魯氏菌的方法，涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明巢式PCR技術(shù)，既可檢測(cè)和鑒定純菌核酸DNA，也可以檢測(cè)和鑒定組織液和血液等微量布魯氏菌核酸DNA；不僅可以鑒定待測(cè)標(biāo)本核酸DNA的布魯氏菌種型，也可以鑒定其生物型。巢式PCR結(jié)果分析可以標(biāo)準(zhǔn)化，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，具有普通PCR技術(shù)的人員就可以完成。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及檢測(cè)和鑒定布魯氏菌菌株和檢測(cè)樣品 (如：血液、血清、組織液，肝脾等)中布魯氏菌DNA的巢式PCR技術(shù)方法，通過(guò)對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序，鑒定其布魯氏菌種型和生物型。運(yùn)用本方法可以快速地從病原學(xué)上對(duì)布魯氏菌病感染做出診斷，以及鑒定其布魯氏菌種型和生物型。

背景技術(shù)

布魯氏菌病(Brucellosis)簡(jiǎn)稱(chēng)布病，又稱(chēng)地?zé)嶂泻３趶垷?、馬耳他熱或波浪熱，俗稱(chēng)“懶漢病”，是由細(xì)胞內(nèi)寄生的布魯氏菌屬(Brucella)細(xì)菌引起的一種人獸共患傳染—變態(tài)反應(yīng)性疾病，布病廣泛分布于世界各地。

目前已知有60多種家畜、家禽、野生動(dòng)物是布魯氏菌的宿主。與人類(lèi)有關(guān)的傳染源主要是羊、牛及豬，其次是犬。病畜的分泌物、排泄物、流產(chǎn)物及乳類(lèi)含有大量病菌，在動(dòng)物間傳播，造成帶菌或發(fā)病。人通過(guò)接觸布病感染的動(dòng)物、食用布魯氏菌污染的奶制品以及實(shí)驗(yàn)室接觸等傳播方式引起布魯氏菌感染。

布魯氏菌為小球桿狀菌，革蘭氏染色陰性。本菌侵入機(jī)體后，隨淋巴液到達(dá)淋巴結(jié)，被吞噬細(xì)胞吞噬。如細(xì)菌未被吞噬細(xì)胞殺滅，則在胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，形成局部原發(fā)病灶。潛伏期為7-60天，平均15天，少數(shù)患者可達(dá)數(shù)月或1年以上。細(xì)菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)大量繁殖導(dǎo)致吞噬細(xì)胞破裂，隨之大量細(xì)菌進(jìn)入淋巴液和血循環(huán)形成菌血癥。在肝、脾、淋巴結(jié)、骨髓等處形成多發(fā)性病灶，造成臨床上不僅有菌血癥、敗血癥，而且還有毒血癥的表現(xiàn)。經(jīng)一定時(shí)期后，感染灶的細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖再次入血，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。如此反復(fù)成為慢性感染，慢性期多侵及脊柱和大關(guān)節(jié)，表現(xiàn)為長(zhǎng)期發(fā)熱(包括低熱)、多汗、關(guān)節(jié)痛兼或肝、脾、淋巴結(jié)和睪丸腫大等臨床癥狀及體征。

布魯氏菌常規(guī)檢測(cè)方法主要有培養(yǎng)方法和虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)、血清凝集試驗(yàn) (SAT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等免疫學(xué)方法。培養(yǎng)中分離到布魯氏菌仍然是布魯氏菌病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但布魯氏菌分離培養(yǎng)的敏感性低、耗時(shí)、費(fèi)力，而且具有較大的生物安全性危害。免疫學(xué)方法目前已經(jīng)用于布魯氏菌病的監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查研究中，但由于在感染早期，機(jī)體還未產(chǎn)生相關(guān)抗體或產(chǎn)生的抗體還未達(dá)到檢測(cè)的限度，得到假陰性結(jié)果；而且布魯氏菌與某些細(xì)菌間又存在交叉反應(yīng)，得到假陽(yáng)性結(jié)果，影響了檢測(cè)的特異性。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR方法(包括普通PCR和熒光定量PCR)已被用于布魯氏菌病的輔助診斷和病原體的檢測(cè)鑒別中。對(duì)待檢樣品中的微量核酸DNA，單一引物的普通PCR和多重PCR方法難以檢測(cè)，對(duì)純菌DNA，單一引物難以鑒定其布魯氏菌的生物型，多重PCR方法可以鑒定其生物型，但操作過(guò)程復(fù)雜，而且對(duì)微量DNA不能檢測(cè)到；熒光定量PCR技術(shù)是一種集PCR技術(shù)、熒光信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析于一體的核酸定量檢測(cè)技術(shù)。對(duì)純菌DNA具有很高的特異性、靈敏性，準(zhǔn)確性及假陽(yáng)性率低等特點(diǎn)，可以檢測(cè)到1 個(gè)拷貝數(shù)的核酸DNA，但是目前熒光定量PCR技術(shù)，由于組織液血液中的影響因素眾多，導(dǎo)致假陽(yáng)性率和假陰性率均較高，影響其在組織血液中布魯氏菌核酸DNA檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明巢式PCR技術(shù)，既可檢測(cè)和鑒定純菌核酸DNA，也可以檢測(cè)和鑒定組織液和血液等微量布魯氏菌核酸DNA；不僅可以鑒定到種型，也可以鑒定到生物型，其檢測(cè)的最低限為1個(gè)拷貝的布魯氏菌核酸DNA，靈敏度等同于熒光定量PCR的水平，而且可以標(biāo)準(zhǔn)化，操作簡(jiǎn)單，具有普通PCR技術(shù)的人員就可以完成。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種快速、特異的微量核酸DNA布魯氏菌種型和生物型的檢測(cè)及鑒定的巢式PCR檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：