[發明專利]一種巢式PCR檢測或/和鑒定布魯氏菌的方法

在審

• 申請號: 201811075543.4
• 申請日: 2018-09-14
• 公開（公告）號: CN109306372A
• 公開（公告）日: 2019-02-05
• 發明（設計）人: 田國忠;姜海;樸東日;趙鴻雁;楊曉雯
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848;C12Q1/04;G16B40/00;C12R1/01
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 張立改

1.一種巢式PCR檢測或/和鑒定布魯氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)待檢測樣品核酸DNA的提取；

(2)引物對的設計：應用軟件分別設計布魯氏菌特異性巢式PCR引物，具體的引物序列包括如下：

第一次PCR擴增引物：

正向引物：SEQ ID NO：1；

反向引物：SEQ ID NO：2；

第二次PCR擴增引物：

正向引物：F2：SEQ ID NO：3；

反向引物：R2：SEQ ID NO：4；

(3)以步驟(1)提取的核酸DNA為模板，利用SEQ ID NO:1-2所示引物，通過PCR反應第一次擴增模板核酸DNA，得到第一次PCR產物的核酸DNA；利用SEQ IDNO:3-4所示引物，通過PCR反應第二次擴增第一次PCR產物的核酸DNA；

(4)檢測并分析PCR擴增產物；反應結束后，進行1％的瓊脂糖凝膠電泳；所述的1％的瓊脂糖凝膠為瓊脂糖：凝膠的質量體積比為0.01g/ml；PCR產物經90V電壓,1％瓊脂糖凝膠電泳1h后，進行凝膠成像分析。

若電泳結果被檢樣品第二次PCR擴增出大小為665-667bp的目的條帶，表明該樣品中布魯氏菌核酸DNA陽性；若電泳結果被檢樣品第二次PCR擴增未有條帶的，表明被檢樣品不存在布魯氏菌核酸DNA；

(5)PCR產物測序：測序引物為正向引物F2和反向引物R2，雙向測序，測通為止；

(6)對步驟(5)測序核苷酸序列進行分析確定種型或生物型。

2.按照權利要求1所述的一種巢式PCR檢測或/和鑒定布魯氏菌的方法，其特征在于，其中PCR擴增反應：將核酸DNA加到PCR反應混合液中，進行PCR擴增；所述PCR反應混合液，包括：PCR反應液、布魯氏菌引物混合液。

3.按照權利要求1所述的一種巢式PCR檢測或/和鑒定布魯氏菌的方法，其特征在于，核苷酸序列分析有兩種方法，任選其一；

第一種方法，將核苷酸序列提交NCBI，BLAST進行匹配分析，結果(sequencesproducing significant arrangements)匹配度最高者(Max score)，即可定為所鑒定的布魯氏菌種及生物型；

第二種方法，采用MEGA5.1軟件，與已知菌種及生物型的布魯氏菌的核苷酸序列進行比對分析，聚類分析結果，待檢樣品的核酸DNA序列與已知核酸DNA序列一致的，即可定為該布魯氏菌種及生物型。

4.按照權利要求1所述的一種巢式PCR檢測或/和鑒定布魯氏菌的方法，其特征在于，第一次PCR反應體系包括：正向引物F1和反向引物R1各0.6μL，待檢測樣品核酸DNA 1-4μl，10×Buffer(Mg²⁺，15mmol/L)2.5μl，4種dNTP Mixture 2μl，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μl)0.2μl，補充雙蒸餾水至25μl體積；

第二次PCR反應體系包括:10×Buffer(Mg²⁺，15mmol/L)2.5μl，4種dNTP混合物溶液2μl，正向引物F2和反向引物R2混合物溶液各0.6μl，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μl)0.2μl，第一次PCR擴增產物核酸DNA 1-4μl，補充雙蒸餾水至25μl體積。

5.按照權利要求4所述的一種巢式PCR檢測或/和鑒定布魯氏菌的方法，其特征在于，引物溶液的濃度為10μmol/L；所述的dNTP混合物溶液中4種NTP(A、T、G和C)的濃度為2.5mmol/L。

6.按照權利要求4所述的一種巢式PCR檢測或/和鑒定布魯氏菌的方法，其特征在于，若為純菌提取的核酸DNA，第一次和第二次PCR反應體系中，加入待測核酸DNA的量都為1μl，其它條件不變。

7.按照權利要求4所述的一種巢式PCR檢測或/和鑒定布魯氏菌的方法，其特征在于，若為組織液或血液中提取的微量核酸DNA，第一次和第二次PCR反應體系中，加入待測核酸DNA的量都為4μl，其它條件不變。