[發(fā)明專利]一種豬非典型瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811075364.0
• 申請日: 2018-09-14
• 公開（公告）號: CN109187952A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐保娟;崔曉霞;孫厚民;王麗萍;宮曉;郭偉偉;李陸梅;郝堯光;王宗升;韓乃君;范根成;杜元釗
• 申請（專利權(quán)）人: 青島易邦生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535;G01N33/569
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種豬非典型瘟病毒蛋白的基因,其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQ IDNO.2。

2.一種用于擴增權(quán)利要求1所述的基因的擴增引物對，其特征在于，所述的引物對的上游引物的序列為SEQ ID NO.3；下游引物的序列為SEQ ID NO.4。

3.一種豬非典型瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含有氨基酸序列為SEQ ID NO:1的豬非典型瘟病毒E2蛋白作為抗原包被的ELISA板、陽性對照血清、陰性對照血清、樣品稀釋液、酶標記結(jié)合物、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B和終止液；

其中陽性對照血清，是用APPV疫苗接種健康豬制成的；

陰性對照血清為健康豬的血清；

所述的E2蛋白，將核苷酸序列為SEQ ID NO.2的E2蛋白編碼基因整合到pET28a載體上構(gòu)建成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌感受態(tài)細胞進行誘導表達，通過His鎳柱分離純化制備的。

4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的樣品稀釋液為用0.01M pH7.2的PBS溶液稀釋的大腸埃希氏桿菌BL21的菌體超聲后的上清溶液。

5.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶標記結(jié)合物是辣根過氧化物酶標記的羊抗豬抗體用酶標抗體稀釋液稀釋12000倍制成的。

6.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的洗滌液，是將14.9g KH₂PO₄，79.1gK₂HPO₄·3H₂O，50.0ml Tritonx-100，1.0g NaN₃，8.0g NaCl溶于500ml水中，調(diào)pH 7.3，最終定容至1L。

7.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的底物溶液A，是將4.2g檸檬酸，13.6g醋酸鈉，0.5g過氧過脲溶解在100ml去離子水中，定容至1L，調(diào)pH值到5.0制成的。

8.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的底物溶液B，是將1g TMB溶解于50ml二甲基亞砜中，溶解后再加入100ml甲醛，16.0g聚乙烯吡咯烷酮，溶解后用去離子水定容至1L完成制備。

9.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的終止液為2mol/L的硫酸溶液。

10.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的ELISA板的制備方法，是將純化的豬非典型瘟病毒E2蛋白抗原用pH 9.5、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液稀釋至25μg/ml，加入96孔包被板中，100μl/孔，置4℃過夜，用洗滌液洗滌3次后，加入含1％BSA 0.01mol/L pH7.2PBS封閉過夜，甩去封閉液，置于室溫、濕度40％之下，自然干燥24-48小時完成制備。