[發(fā)明專利]一種槲皮素糖苷的生物合成方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811073927.2
• 申請日: 2018-09-14
• 公開（公告）號: CN109234337B
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈紅華;李艷;蔡如鑫;嚴(yán)明;陳可泉
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12P19/18
• 分類號: C12P19/18;C12P19/60
• 代理公司: 南京新慧恒誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32424
• 代理人: 王月霞

本發(fā)明公開了一種槲皮素糖苷的生物合成方法,將糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73G1突變體的基因與蔗糖合酶基因連接得到重組質(zhì)粒，構(gòu)建含雙酶體系的重組菌；將重組菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，添加誘導(dǎo)劑乳糖誘導(dǎo)，發(fā)酵液離心收集菌體，菌體破碎，離心收集上清液得到粗酶液；將槲皮素或異槲皮素溶于DMSO中，加入粗酶液、蔗糖，反應(yīng)，離心得上清槲皮素?3，4’?二葡萄糖糖苷。所述糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73G1突變體的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示序列發(fā)生V371A和/或F381Y突變的氨基酸序列。該突變體制備簡單，產(chǎn)量大，實(shí)現(xiàn)了槲皮素?3，4’二葡萄糖糖苷產(chǎn)量的提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種槲皮素糖苷的生物合成方法。

背景技術(shù)

槲皮素（Quercetin），又稱櫟精、槲皮素黃，作為一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于植物的花、葉、果實(shí)中，多以甙的形式存在，具有很好的祛痰、止咳作用。此外還有降低血壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力、減少毛細(xì)血管脆性、降血脂、擴(kuò)張冠狀動脈，增加冠脈血流量等作用。在美國，槲皮素治療前列腺癌已是非處方藥，但在中國，還沒批準(zhǔn)該藥物作為前列腺治療藥物。槲皮素不溶于水，導(dǎo)入親水性基團(tuán)可增加其溶解性，便于吸收，從而增強(qiáng)其藥理作用，將槲皮素糖基化是一種增加其溶解性的有效手段。專利201110343655.5報道了利用糖苷酶對槲皮素進(jìn)行糖基化作用，產(chǎn)量0.148g/L,轉(zhuǎn)化率14.81%.轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量相對較低。目前國內(nèi)外糖基化合物的研究熱點(diǎn)主要是黃酮衍生物的合成，但是由于大多數(shù)黃酮苷元及其黃酮苷類在水相中溶解度低，限制了其制劑的開發(fā)。槲皮素-3，4’-二葡萄糖糖苷是槲皮素糖基化的產(chǎn)物，比槲皮素有更好的水溶性和藥理作用。它存在于洋蔥的表皮細(xì)胞中，但含量極少，表皮細(xì)胞干重含量只有0.2g-7.4g/kg，提取困難。由于槲皮素來源廣泛，且蘆丁水解成槲皮素和異槲皮素工藝成熟。因此利用微生物轉(zhuǎn)化具有原料優(yōu)勢，便于槲皮素-3，4’-二葡萄糖糖生產(chǎn)的應(yīng)用。微生物轉(zhuǎn)化法通過一步轉(zhuǎn)化，工藝簡單，便于調(diào)控，目前國內(nèi)關(guān)于制備槲皮素-3，4’-二葡萄糖糖苷報道較少。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種槲皮素糖苷的生物合成方法；

本發(fā)明的另一目的是提供一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及其制備方法，利用該基因?qū)崿F(xiàn)槲皮素的糖基化修飾，制備得到槲皮素-3，4’二葡萄糖糖苷，并為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的借鑒。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請采用的技術(shù)方案為：

一種適用于槲皮素糖苷合成的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示發(fā)生突變的氨基酸序列，突變的氨基酸位點(diǎn)選自S151，T168，K274，T293，G361,S365,V371及F381中的一個或多個。

進(jìn)一步地，突變的氨基酸位點(diǎn)發(fā)生的突變包括如下任意一種或多種：S151T，T168S，K274W/E，T293G/V，G361K,S365T,V371A/G,F381Y，其中，“/”表示“或”。

F381Y為SEQ ID NO:1序列中第381位氨基酸由苯丙氨酸（F）突變?yōu)槔野彼幔╕）；S151T為ID NO:1序列中第151位氨基酸由絲氨酸（S）突變?yōu)樘K氨酸（T），T168S為ID NO:1序列中第168位氨基酸由蘇氨酸（T）突變?yōu)榻z氨酸（S），K274W/E為ID NO:1序列中第274位氨基酸由賴氨酸（K）突變?yōu)樯彼幔╓）或谷氨酸（E），T293G/V為ID NO:1序列中第293位氨基酸由蘇氨酸（T）突變?yōu)楦拾彼幔℅）纈氨酸（V），G361K為ID NO:1序列中第361位氨基酸由甘氨酸（G）突變?yōu)橘嚢彼幔↘），S365T為ID NO:1序列中第365位氨基酸由絲氨酸（S）突變?yōu)樘K氨酸（T），V371A為ID NO:1序列中第371位氨基酸由纈氨酸（V）突變?yōu)楸彼幔ˋ）或甘氨酸（G）。

一種表達(dá)基因，該基因編碼上述任一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體。

一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒連接有上述表達(dá)基因和蔗糖合酶基因SUS。