[發(fā)明專利]一種高生物活性細(xì)胞膜仿生微囊泡及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811073228.8
• 申請(qǐng)日: 2018-09-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109136189B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚蔚泓;劉巧玲;劉學(xué)嬌;畢成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;C12N5/071
• 代理公司: 長(zhǎng)沙楚為知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43217
• 代理人: 陶祥琲

本發(fā)明提供一種高生物活性細(xì)胞膜仿生微囊泡及其制備方法與應(yīng)用，該方法具體是一種將貼壁細(xì)胞與納米材料孵育后，置于生物相容性緩沖液中并于白光光源光照下，制備高生物活性細(xì)胞膜仿生微囊泡的方法。該方法與化學(xué)試劑誘導(dǎo)法(多聚甲醛和二硫蘇糖醇)相比，其產(chǎn)率顯著提高，是化學(xué)試劑誘導(dǎo)法的的3～6倍；且該方法普適性好，能適用于所有貼壁細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞。該方法制備出來(lái)的細(xì)胞膜仿生微囊泡保持較好的生物活性和生物相容性，其具有類似細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，是研究精準(zhǔn)藥物遞送、細(xì)胞仿生以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的理想模型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種細(xì)胞膜仿生微囊泡的制備方法與應(yīng)用，尤其涉及一種具有高生物活性的細(xì)胞膜仿生微囊泡及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

仿生微囊泡主要是由磷脂和蛋白組成的、類似細(xì)胞膜的封閉雙分子層結(jié)構(gòu)。仿生微囊泡具有類似細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、類似細(xì)胞大小的尺寸，以及可提供相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境的特點(diǎn)，因此被廣泛用于細(xì)胞仿生研究。目前，仿生微囊泡被用于模擬生命活動(dòng)過(guò)程，模擬細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能以及構(gòu)筑智能仿生系統(tǒng)，引起化學(xué)和生物交叉領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。研究顯示，具有類似細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的仿生微囊泡是用于細(xì)胞仿生研究的理想模型，目前，細(xì)胞膜仿生微囊泡主要作為細(xì)胞膜模型用來(lái)研究細(xì)胞膜的相結(jié)構(gòu)和相分離、細(xì)胞膜脂筏區(qū)的性質(zhì)、以及生物分子相互作用等。

化學(xué)合成法(水合法、乙醇注射法、雙重乳劑法等)是制備微囊泡的常用方法。雖然化學(xué)合成的微囊泡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成分可調(diào)控，但是這種微囊泡缺乏生物活性組分，難以模擬天然細(xì)胞膜復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。相對(duì)而言，從細(xì)胞中提取的細(xì)胞膜仿生微囊泡由于具有類似細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和組分，有利于細(xì)胞仿生研究。

目前，從細(xì)胞中提取細(xì)胞膜仿生微囊泡的方法主要使用化學(xué)試劑誘導(dǎo)法或者高鹽試劑誘導(dǎo)法，例如：Erdinc Sezgin等人采用含有多聚甲醛、二硫蘇糖醇的緩沖液與細(xì)胞孵育，從而獲取細(xì)胞膜微囊泡，但二硫蘇糖醇是一種還原劑，可以破壞蛋白質(zhì)中半胱氨酸間的二硫鍵，多聚甲醛能使蛋白交聯(lián)，因此影響細(xì)胞膜微囊泡的生物活性；Cohen等人采用低滲溶液處理細(xì)胞，通過(guò)將細(xì)胞與緩沖液孵育使細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞膜微囊泡，但這種方法僅對(duì)基底具有高粘附能力的細(xì)胞(如，表皮樣癌細(xì)胞系A(chǔ)431)有效；Nuala Del Piccolo等人利用含有氯鹽的緩沖溶液(200mM NaCl，5mM KCl，0.5mM MgCl₂，0.75mM CaCl₂溶解在pH＝8.5的N，N-二羥乙基甘氨酸中)從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中提取細(xì)胞膜微囊泡，然而進(jìn)行后續(xù)研究時(shí)，這種制備方法存在需要分離細(xì)胞膜微囊泡的問(wèn)題。總之，現(xiàn)有的制備細(xì)胞膜微囊泡的方法存在以下問(wèn)題：(1)化學(xué)試劑或者高鹽緩沖液不利于保持細(xì)胞膜上生物分子的活性，不利于長(zhǎng)時(shí)間保存；(2)由于使用生物不相容緩沖液，需要繁瑣的分離提純操作，費(fèi)時(shí)費(fèi)力、產(chǎn)率低，不利于后續(xù)研究。

對(duì)比文件1：CN106289927A公開(kāi)一種從腫瘤細(xì)胞上清中分離微囊泡及其外泌體的方法，所述方法為：將腫瘤細(xì)胞貼壁培養(yǎng)后，取培養(yǎng)液離心，取上清液與偶聯(lián)復(fù)合物混合，在4℃、100～300rpm水平振蕩條件下孵育3～16h，去除液體，獲得孵育后的偶聯(lián)復(fù)合物并用PBS緩沖液清洗，獲得吸附微囊泡的偶聯(lián)微球；本發(fā)明采用的方法提取的總微囊泡，保留了全部微囊泡的結(jié)構(gòu)和成分，產(chǎn)量高。并且可以進(jìn)行二次分選，對(duì)特定的微囊泡進(jìn)行分析，提高了提取效率和研究?jī)r(jià)值。總共的提取時(shí)間最少只要4小時(shí)，就可以完成微囊泡的提純，最少5小時(shí)可以完成外泌體的提純。該對(duì)比文件公開(kāi)的方法通過(guò)偶聯(lián)復(fù)合物提取微囊泡，雖然可以保留微囊泡的結(jié)構(gòu)和成分，具有較好的生物活性，但是其生物相容性不佳，且上述方法主要適用于腫瘤細(xì)胞，普適性也有待提高。

針對(duì)相關(guān)研究現(xiàn)狀，本發(fā)明擬提出一種產(chǎn)率高、普適性好、可使生物分子保持較好生物活性的細(xì)胞膜仿生微囊泡的制備技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種高生物活性細(xì)胞膜仿生微囊泡的制備方法，該方法普適性好，制備出來(lái)的細(xì)胞膜仿生微囊泡產(chǎn)率高且保持較好的生物活性和生物相容性，其具有類似細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，是研究精準(zhǔn)藥物遞送、細(xì)胞仿生以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的理想模型。