[發(fā)明專利]一種粳稻典染敗恢復(fù)系分子標(biāo)記高效輔助選擇方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811072234.1
• 申請(qǐng)日: 2018-09-14
• 公開（公告）號(hào): CN109486986B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王先俱;張城;龐秀;姜偉;陳亞君;丁芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 遼寧省水稻研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種粳稻典染敗恢復(fù)系分子標(biāo)記高效輔助選擇方法，其特征在于，包括以下操作步驟：

(1)分別用引物RM5629、引物RM10353標(biāo)記四個(gè)水稻親本晚輪422、R498、R527、C418的第一、十染色體恢復(fù)基因SSR，然后進(jìn)行擴(kuò)增，電泳，得到四個(gè)水稻親本的恢復(fù)系基因型，R498的恢復(fù)系基因型為Rf1Rf1Rf10Rf10，R527的恢復(fù)系基因型為Rf1Rf1Rf10Rf10，C418的恢復(fù)系基因型為Rf10Rf10，晚輪422的恢復(fù)系基因型為Rf1Rf1Rf10Rf10；

(2)將四個(gè)水稻親本之間雜交晚輪422/R498、晚輪422/R527、C418/R498、C418/R527，然后得到F₂代群體恢復(fù)系基因分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)果，在F₂代分離群體中分子標(biāo)記輔助選擇的恢復(fù)系泳道，基因型Rf1Rf1Rf10Rf10，因此在F₂代分離群體中的22個(gè)株系中選擇到2株帶有純合顯性恢復(fù)基因的恢復(fù)系；

(3)對(duì)F₄代進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，在F₄代分離群體中分子標(biāo)記輔助選擇的恢復(fù)系范圍擴(kuò)大了，具有純合基因型Rf1Rf1Rf10Rf10的有18株，因此在四代與二代分離群體相比較，選擇效率提高了9倍；

其中RM5629引物的序列為：AGCTCAACTCGAGAACTCCC，RM10353引物的序列為：TTGTTAGTTGGCGAAAGGAA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粳稻典染敗恢復(fù)系分子標(biāo)記高效輔助選擇方法，其特征在于，總DNA具體提取方法如下：(1)取約0.1g嫩葉放入到2ml離心管中，加入CTAB緩沖液900μL，用無菌棒將葉片快速搗碎；(2)65℃水浴30min后取出，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，顛倒混勻10分鐘；(3)4℃離心，8000-12000rpm離心10min；(4)取上清液移至另一1.5ml新離心管，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，將離心管輕柔混勻5min；(5)4℃離心，10000rpm離心10min；(6)棄上清液，用70％乙醇洗滌1次后再用95％乙醇洗滌；(7)風(fēng)干后，加入適量已滅菌的TE溶液稀釋，其中CTAB緩沖液為10ml 1mol/L Tris-HCl、4ml 0.5mol/L EDTA、10ml5mol/L NaCl，加去離子水定容至100ml，TE溶液為1ml 1mol/L Tris-HCl、0.2ml 0.5mol/LEDTA、98.8ml去離子水。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粳稻典染敗恢復(fù)系分子標(biāo)記高效輔助選擇方法，其特征在于，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃下預(yù)變性5min，94℃下變性30s，退火30s，退火溫度為47℃，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min；擴(kuò)增產(chǎn)物用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳，取反應(yīng)產(chǎn)物2μL與1μL電泳緩沖液混勻，電泳緩沖液為TBE溶液，120V恒壓電泳1.5h，經(jīng)0.05％的AgNO₃溶液染色15分鐘、顯色后進(jìn)行特異性檢測(cè)，其中TBE溶液由以下組分制成：54gTris堿、27.5g硼酸、20ml 0.5mol/L EDTA，加水定容至1000ml。