[發明專利]一種人脂肪干細胞條件培養基的制備方法

在審

• 申請號: 201811071100.8
• 申請日: 2018-09-13
• 公開（公告）號: CN109161521A
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 鄭桂純;陳志勝;趙姝燦;黃麗貞;張曉芳
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 王國標

本發明公開了一種人脂肪干細胞條件培養基的制備方法，其包括如下操作步驟：1)分離培養人脂肪干細胞；2)條件培養基制備：取傳代培養中的P3至P6代次人脂肪干細胞，加入無血清培養基繼續培養48h后收集細胞培養基上清液，對上清液進行離心處理20min，用0.22μm濾器過濾后獲得人脂肪干細胞條件培養基。本發明的人脂肪干細胞條件培養基可以極顯著地提高衰老的人皮膚成纖維細胞的活力，初步證實該條件培養基具有延緩皮膚衰老的作用，可將其應用于美容護膚品行業，且該條件培養基不含血清等復雜成分，在應用中降低了出現過敏反應的可能性，有利于在生產實際中的應用。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，特別涉及一種人脂肪干細胞條件培養基的制備方法。

背景技術

在細胞培養過程中，細胞會分泌活性物質到培養基中，其中細胞因子是主要的活性物質之一，這種含有細胞分泌物的培養基就叫做條件培養基。利用條件培養基可有效提高細胞或組織體外培養的成功率，促進細胞增殖。脂肪干細胞(adipose-derived stemcells，ADSCs)是脂肪組織中一類多能干細胞，其含量豐富，易于分離，供區易被患者接受，被認為是有極大應用前景的干細胞。研究表明ADSCs能夠增強細胞增殖、遷移的活力，提高受損細胞生命力、拮抗細胞凋亡，在抗衰老方面具有顯著的作用，且具有旁分泌功能，合成分泌多種類型細胞因子和成分，包括表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF)等，可促進成纖維細胞增殖及膠原的分泌，使真皮內膠原含量增加，分泌大量新的細胞外基質成分，從而修復原有的真皮層彈性纖維斷裂，重建、修復皮膚結構，達到皮膚真皮變厚、皮膚彈性增加，從而改善皮膚質地。

皮膚衰老是組織結構變化的外在表現，皮膚的表皮層、真皮層以及皮膚附屬器的組織均會隨著機體年齡的增長而發生相應改變，最具有特征性的變化是真皮層成分的變化。真皮層成分變化的內因是成纖維細胞衰老，延緩或抑制成纖維細胞的老化是治療和預防皮膚衰老的關鍵。“愛美之心人皆有之”，為了保持年輕的肌膚狀態，越來越多的消費者開始使用具有抗衰老功效的化妝品或采用面部提拉手術、透明質酸充填、肉毒素注射等年輕化技術，這些方法可以達到一定的效果。但這些方法都只是在皮膚外觀上達到美化的作用，并不能真正從生理上達到抗皮膚衰老的作用。

脂肪干細胞具有抗衰老作用，但考慮倫理問題，成體干細胞具有潛在的致癌性，注射細胞并不是最理想的方法。研究表明，脂肪干細胞分泌的因子具有抗衰老作用，所以脂肪干細胞條件培養基有望擁有脂肪干細胞對皮膚的修復重建功能，其亦是避免倫理問題、致癌性、過敏反應的最有效工具。

發明內容

本發明的目的在于針對上述現有技術的不足，提供一種人脂肪干細胞條件培養基的制備方法。

本發明所采取的技術方案是：一種人脂肪干細胞條件培養基的制備方法，其包括如下操作步驟：

1)分離培養人脂肪干細胞：取人脂肪組織，PBS溶液清洗、離心處理5min，取下層脂肪組織，加入Ⅰ型膠原蛋白酶溶液消化，離心處理，去除上層油脂和下層膠原酶溶液，然后用PBS溶液重懸沉淀，吹散后用200目細胞濾網過濾，離心處理10min，棄上清，加入完全培養基重懸，接種于培養板中傳代培養；

2)條件培養基制備：取傳代培養中的P3至P6代次人脂肪干細胞，待人脂肪干細胞生長至75～85％培養基時，棄去培養基，PBS溶液清洗，加入無血清培養基繼續培養48h后收集細胞培養基上清液，對上清液進行離心處理20min，用0.22μm濾器過濾后獲得人脂肪干細胞條件培養基，4℃保存備用。

作為上述方案的進一步改進，步驟1)中所述完全培養基為含有10％胎牛血清的低糖DMEM培養基。

作為上述方案的進一步改進，步驟2)中所述無血清培養基為含有雙抗的DMEM/F12基礎培養基。