[發(fā)明專(zhuān)利]細(xì)菌性敗血癥（FBS）的RAA恒溫?zé)晒鈾z測(cè)方法及試劑

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811069556.0
• 申請(qǐng)日: 2018-09-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110894532A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程奇;錢(qián)冬;黃震巨;張建勛;肖文;余國(guó)君;鄭善堅(jiān)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 杭州眾測(cè)生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/689
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天昊專(zhuān)利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)菌性敗血癥（FBS）RAA恒溫?zé)晒鈾z測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒。檢測(cè)試劑盒包括一條正向引物SEQ ID NO.1、一條反向引物SEQ ID NO.2、一條特異性熒光探針SEQ ID NO.3、反應(yīng)液、重組聚合酶和對(duì)照品。本發(fā)明的試劑盒特異性強(qiáng)；檢測(cè)靈敏度高，可達(dá)到0.1fg/μL；準(zhǔn)確度高、可靠；操作簡(jiǎn)便快捷，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的檢測(cè)方法，具體涉及一種嗜水氣單孢菌的RAA恒溫?zé)晒鈾z測(cè)方法及試劑盒。

背景技術(shù)

淡水魚(yú)養(yǎng)殖中,細(xì)菌性敗血癥(FBS)是危害最大的一種細(xì)菌性傳染疾病。該病是由嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、魯氏耶爾森菌、豚鼠氣單胞菌、河弧菌生物變種Ⅲ和產(chǎn)堿假單胞菌等多種革蘭氏陰性桿菌感染引起。其主要是由嗜水氣單胞菌所引起的。本病在全國(guó)各地都有流行,主要危害鰱、鳙、鯉、鯽、團(tuán)頭魴、白鯽、黃尾鲴、鯪等。近年來(lái),名優(yōu)魚(yú)類(lèi)如鱖、斑點(diǎn)叉尾鮰等也有病例報(bào)告,主要危害1足齡以上的魚(yú),但近年來(lái)已擴(kuò)大到2月齡的魚(yú)種。

作為暴發(fā)性流行病其危害最重，流行最廣，周期最長(zhǎng)，殃及的魚(yú)類(lèi)品種最多，死亡率最高，患此病的魚(yú)從發(fā)現(xiàn)癥狀到死亡僅3～5天，短期內(nèi)會(huì)造成大幅度死魚(yú)，甚至絕產(chǎn)，是池塘養(yǎng)殖的惡性病害。池塘混養(yǎng)中最早發(fā)病的是鯽、白鯽或鰱，隨后為團(tuán)頭魴和鳙。疾病流行溫度為9-36℃,以28-32℃為高峰，6-7月份容易急性暴發(fā)。該病危害多種養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，特別是鰱和鳙等濾食性魚(yú)類(lèi)，通常以浮游生物為食,對(duì)人工投喂的飼料攝食不多,加上湖泊和水庫(kù)等大水體也普遍發(fā)生該病,這給藥物防治工作帶來(lái)困難。因此，在前期做好魚(yú)類(lèi)疾病的預(yù)防檢測(cè)就很重要。

對(duì)于病害檢測(cè)這方面使用方法主要有鏡檢觀察，分子檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè)。PCR分子檢測(cè)方法是最為常用的檢測(cè)方法之一，其方法敏感、準(zhǔn)確、快速而被廣泛應(yīng)用，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、較高檢測(cè)費(fèi)用以及對(duì)檢測(cè)人員較高的技術(shù)要求而使其不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和普及使用。本發(fā)明建立了RAA恒溫?zé)晒鈦?lái)檢測(cè)細(xì)菌性敗血癥的方法，快速方便，準(zhǔn)確可靠，是適應(yīng)口岸快速檢測(cè)和大通關(guān)的時(shí)代要求，對(duì)促進(jìn)中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖及其產(chǎn)品的貿(mào)易有重要作用。

重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技術(shù)也是一種在恒溫下可以使核酸快速擴(kuò)增的方法。與RPA不同的是，RAA擴(kuò)增法使用的是從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶，在37℃恒溫下，該重組酶可與引物DNA緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全互補(bǔ)的序列時(shí)，在單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的幫助下，使模板DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補(bǔ)鏈，反應(yīng)產(chǎn)物也是以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，通常在1h內(nèi)即能得到可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到的擴(kuò)增片段。在RAA反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)RAA擴(kuò)增過(guò)程，20分鐘內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量及定性分析。整個(gè)反應(yīng)簡(jiǎn)單快速，因?yàn)椴恍枰邷匮h(huán)，所以特別適合在有大量樣品的非實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)場(chǎng)所使用，適用于食品快速檢測(cè)領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供細(xì)菌性敗血癥(FBS)的RAA恒溫?zé)晒夂怂釞z測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種細(xì)菌性敗血癥(FBS)核酸的檢測(cè)試劑盒，包括：細(xì)菌性敗血癥正向引物、反向引物以及特異性熒光探針，其中所述細(xì)菌性敗血癥正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述細(xì)菌性敗血癥反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特異性熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

在一些實(shí)施方案中，所述特異性熒光探針的熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一種，熒光淬滅基因選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一種。