[發(fā)明專(zhuān)利]細(xì)菌性敗血癥（FBS）的RAA恒溫?zé)晒鈾z測(cè)方法及試劑

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811069556.0
• 申請(qǐng)日: 2018-09-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110894532A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程奇;錢(qián)冬;黃震巨;張建勛;肖文;余國(guó)君;鄭善堅(jiān)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 杭州眾測(cè)生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/689
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天昊專(zhuān)利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

1.一種細(xì)菌性敗血癥（FBS）核酸的檢測(cè)試劑盒，包括：細(xì)菌性敗血癥正向引物、反向引物以及特異性熒光探針，其中所述細(xì)菌性敗血癥正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述細(xì)菌性敗血癥反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特異性熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測(cè)試劑盒，所述特異性熒光探針的熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一種，熒光淬滅基因選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的核酸檢測(cè)試劑盒，還包括引物混合液、特異性熒光探針、ABuffer、B Buffer、RAA干粉試劑、細(xì)菌性敗血癥標(biāo)準(zhǔn)品和ddH₂O中至少一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中，所述A Buffer為20% PEG ；B Buffer為280mMMgAc。

5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中，所述的RAA干粉試劑的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重組酶蛋白（SC-recA/BS-recA）或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20% PEG、5mmol/L 二硫蘇糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸檢測(cè)試劑盒，細(xì)菌性敗血癥標(biāo)準(zhǔn)品為含有嗜水氣單孢菌基因部分序列的陽(yáng)性質(zhì)粒。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，所述含有嗜水氣單孢菌基因部分序列的陽(yáng)性質(zhì)粒的序列如SEQ ID NO.4所示。

8.細(xì)菌性敗血癥的RAA恒溫?zé)晒鈾z測(cè)方法，提取待測(cè)樣品的DNA，以待測(cè)樣品的DNA 為模板，在細(xì)菌性敗血癥的正向引物、反向引物、特異性熒光探針及RAA干粉試劑、A Buffer、BBuffer和ddH₂O存在下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RAA反應(yīng)，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光RAA擴(kuò)增曲線(xiàn)分析待測(cè)樣品；其中所述細(xì)菌性敗血癥正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示、所述細(xì)菌性敗血癥反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示，所述特異性熒光探針的核苷酸序列如SEQ IDNo.3，其5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，特征在于包括以下的步驟：

（1）、嗜水氣單孢菌菌株的純化分離：從待檢魚(yú)類(lèi)組織中使用無(wú)菌接種環(huán)取樣劃線(xiàn)于AHM平板上進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，純化分離菌株；

（2）、嗜水氣單孢菌DNA溶液的制備：：在離心管中加入50μL 無(wú)菌TE 溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)，挑取單菌落至上述TE 溶液中，將離心管放置在渦旋混合器上充分震蕩10s，沸水煮10min，冷卻至室溫，再充分震蕩10s 后12000r/min 離心2min，上清液即為DNA，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>