[發明專利]一種嵌合共刺激轉換受體、編碼基因、重組表達載體、抗腫瘤NK細胞及其制備方法、應用

有效

• 申請號: 201811068231.0
• 申請日: 2018-09-13
• 公開（公告）號: CN109096404B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 朱武凌;李明風;王曉銀;呂探宇;路臣桂;張會勇;牛志遠;郭長江
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/867;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 李寧

本發明涉及一種嵌合共刺激轉換受體、編碼基因、重組表達載體、抗腫瘤NK細胞及其制備方法、應用，屬于腫瘤免疫細胞治療技術領域。本發明中的嵌合共刺激轉換受體由PD1胞外段（1?170aa），DAP10胞外、跨膜及胞內段（19?93aa）以及共刺激分子41BB胞內段（214?255aa）組成，DAP10中不含有會影響其跨膜的信號肽，但是包含胞外域，胞外域含有糖基化位點，能夠招募游離的NKG2D，大大增強NK細胞的激活。根據上述嵌合共刺激轉換受體可以得到其編碼基因和重組表達載體，將重組表達載體轉入NK細胞中，能夠得到抗腫瘤NK細胞，其具有極高的細胞毒性。

技術領域

本發明涉及一種嵌合共刺激轉換受體、編碼基因、重組表達載體、抗腫瘤NK細胞及其制備方法、應用，屬于腫瘤免疫細胞治療技術領域。

背景技術

近年來，腫瘤免疫細胞治療因其顯著的療效而在腫瘤治療中大放異彩，特別是基于嵌合抗原受體改造的T細胞（CAR-T），在血液系統惡性腫瘤的臨床治療中展現出良好的靶向性、殺傷力和持久性，其為腫瘤免疫治療領域最令人信服的突破，為攻克腫瘤打開了新的希望之門。盡管CAR-T技術研發不斷取得進步，但卻依然面臨著諸多挑戰。主要障礙之一為：CAR-T雖然具備強大殺死癌細胞的能力，但其本身所引起的過強免疫應答反應潛在威脅患者生命。并且無論CAR-T或是TCR-T等免疫細胞技術，迄今為止對實體瘤的治療鮮有奏效，而治療實體瘤恰是抗腫瘤的真正主戰場。因此，如何克服CAR-T技術的弊端以及如何能賦予免疫細胞對實體瘤細胞的精準識別與特異殺傷，成為免疫細胞治療亟待實現的新突破和新跨越。

NK細胞是機體重要的免疫細胞，約占健康人外周血淋巴細胞總數的10%。NK細胞在實體瘤發生發展的早期免疫反應和免疫監視過程中發揮重要作用，為機體抵抗腫瘤的第一道防線，利用NK細胞進行臨床治療已有較長歷史。與T細胞相比，NK細胞具有許多自身的免疫特性和優勢：一是它具有不受HLA限制的非特異性腫瘤細胞殺傷作用，主要是通過表面細胞毒受體，觸發穿孔素和顆粒酶的釋放，產生細胞毒因子和TNF等細胞因子，而不產生IL-2等細胞因子，避免造成致死性細胞因子風暴；二是NK細胞還可通過CD16與抗體Fc片段結合，誘發ADCC特異性殺傷作用；三是NK細胞的殺傷作用具有連續性，可從一個目標移向另一個目標，殺死多達7-10個腫瘤細胞，而T細胞缺乏這種連續殺傷性；四是因為NK細胞壽命短暫，發揮功效后很快會消失，勿需更多考慮類似CAR-T細胞需要自殺基因來限制其持久副作用，這顯然要優于T細胞。由于這些有利因素，NK細胞用于患者治療時有效并且安全。利用NK92而不是T細胞作為宿主細胞，使CAR-NK相比CAR-T，具有更高的安全性和可控性。

免疫檢查點是指一類免疫抑制性分子，通過共抑制或共刺激信號一系列途徑來調節免疫細胞活性，防止過度免疫激活和確保自身耐受，從而避免正常組織損傷和破壞。程序性死亡受體（ProgrammedDeath1，PD1）是其中一個主要的抑制分子，它具有一個ITSM結構，在與配體PD-L1結合后能夠磷酸化，并招募酪氨酸磷酸酶SHP-2，引發抗原受體復合體的去磷酸化，從而抑制通路下游的激活信號，使免疫細胞活化受阻，發揮對免疫細胞活性的負向調控作用。大量研究證據表明，PD1主要表達于活化的免疫細胞表面，其配體PD-L1在正常組織中表達有限，但在大部分實體瘤細胞和免疫抑制細胞中的表達顯著增加，腫瘤利用PD1/PD-L1負調控機制實現對抗腫瘤免疫反應的逃逸。目前多項臨床前研究和臨床試驗均指出，采用PD-L1或PD1阻斷抗體來增強癌癥患者的抗腫瘤免疫應答可作為一種新型的腫瘤免疫治療手段，并且能夠獲得持續性的臨床應答。更有意義的是，研究發現利用PD1細胞外段和CD28跨膜段及胞內段構建一個嵌合共刺激開關受體，將其引入針對實體瘤靶抗原的CAR-T細胞，相比現在單獨使用PD1抗體治療或CAR-T細胞治療都有更多更好的效果。

申請公布號為CN107974433A的中國發明專利申請中公開了一種增強型抗腫瘤NK細胞，其為經雙重靶向嵌合受體改造的NK細胞，所述的雙重靶向嵌合受體由PD1胞外段、NKG2D全長段，以及共刺激分子41BB胞內段組成；該抗腫瘤NK細胞用于殺死H1299肺癌細胞時，其細胞毒性較低，僅為親本NK92的3-4倍，不能滿足實體腫瘤的治療需求。