[發明專利]一種基于分子信標的熒光環介導等溫擴增方法

在審

• 申請號: 201811067779.3
• 申請日: 2018-09-13
• 公開（公告）號: CN109055500A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 黃留玉;劉威;黃思妺;劉寧偉;鄒大陽;董德榮;楊展;敖大;賀小明
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;秦夢楠

本發明公開了一種基于分子信標的熒光環介導等溫擴增方法。本發明將分子信標引入到LAMP技術，建立了基于分子信標的熒光環介導等溫擴增方法，并將其命名為MB?LAMP，從而實現了對擴增產物的直接檢測，從根本上解決了LAMP方法非特異擴增的問題，具有巨大的應用價值和商業價值。

技術領域

本發明涉及一種基于分子信標的熒光環介導等溫擴增方法。

背景技術

環介導等溫擴增技術是由Notomi在2001年建立的一種新型體外核酸擴增檢測技術。它使用4-6條引物去鑒定6-8段特異性的核酸片段。DNA聚合酶具有鏈置換功能，在它的幫助下，目的基因可以在很短的時間內，恒溫的條件下，得到高效、特異的擴增。與此同時，反應析出大量的白色焦磷酸鎂沉淀，利用這個特點，實驗人員可以通過觀察反應體系的渾濁程度來判斷結果是陰性還是陽性。由于LAMP反應是在恒溫條件下進行的，所以一個穩定的熱源(例如水浴或者金屬浴)就能滿足實驗條件的要求，與此同時，實驗的儀器費用也大大降低了。由于上述LAMP的諸多優點，它已經在微生物檢測，例如細菌，真菌，病毒以及基因疾病檢測，嬰兒早期性別診斷等方面得到了普遍的應用。

PCR是利用兩條引物特異地識別目的片段的兩個區域，而LAMP是識別了6-8個獨立的基因片段，因此從理論上講，LAMP應該比PCR具有更高的特異性，但是事實卻并非如此。因為引物數目較多，所以LAMP更容易遇到由非特異擴增而帶來的假陽性問題，這一點已經被數位研究者所證實。而更重要的是，由于傳統的檢測方法都是間接地對反映產物進行檢測，所以不能從真實的結果當中分辨出這種假陽性。傳統的檢測方法原理大致如下：

1、電泳法：利用傳統的凝膠電泳法對LAMP的反映產物進行條帶分析。但是由于LAMP擴增出來的片段大小是不規則的，所以電泳結果呈彌漫狀態。無論哪一系列引物或者模版參與反應，電泳的結果都幾乎相似，所以我們不能根據條帶的形狀和大小判定是否有假陽性的結果產生。同時電泳的方式很容易產生氣溶膠污染，這將會影響LAMP的實驗結果。

2、SYBR GreenⅠ染色法：SYBR GreenⅠ在結合到DNA雙鏈結構上以后，可被紫外光激發而發光。利用這種特性，在LAMP反應結束以后向產物中滴加SYBR GreenⅠ，我們就可以在紫外光下根據綠色熒光而判讀實驗結果。但是，除了擴增產物，SYBR GreenⅠ可以結合所有的雙鏈DNA而發光，從而造成了結果不易判讀、高熒光背景值的情況。除此之外，由于SYBRGreenⅠ需要在反應結束后打開反應管再加入，這樣反映就不能在一個密閉體系內進行，從而會發生氣溶膠污染的情況。

3、沉淀法：LAMP反應過程中會產生焦磷酸鎂沉淀，而且產生的量比較大，反應完成后通過離心的作用，可以把所有沉淀聚集在一起，通過肉眼觀察便可以判斷結果，但由于焦磷酸鎂在溶液體系中具有非常好的分散性，離心聚集后可以瞬間再次分散到反應溶液中，這樣就容易產生假陰性。

4、羥基萘酚藍染色(HNB)：羥基萘酚藍染色是一種金屬離子指示劑，它能根據溶液中Mg²⁺的不同而顯示出不同的顏色，由于LAMP反應中產生焦磷酸鎂沉淀，會大量消耗Mg²⁺，這樣HNB的顏色就會改變，但HNB不穩定，不容易保存，需要現用現配，使用起來不方便，另一個問題是HNB的顏色反應不明顯，不容易察覺顏色變化，雖然目前很多研究者在使用本方法，但并沒有獲得大家的認可。

5、濁度法：濁度法是目前研究LAMP反應獲得認可最多的方法，它通過實時濁度儀檢測反應體系濁度的變化，并繪制曲線以反映反應結果，由于全程由儀器來監測，排除了人為判斷的干擾，結果可信，再者這種方法可以真實再現LAMP反應的時間點，反應效率等參數，在對于最佳引物篩選實驗、最佳溫度實驗具有非常好的指導意義，是研發LAMP試劑盒必不可少的儀器。