[發(fā)明專利]用于檢測(cè)草魚(yú)出血病毒的特異性引物對(duì)、探針、檢測(cè)試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811067067.1
• 申請(qǐng)日: 2018-09-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109182599A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁銳;高山珊;王晶晶;貢成良;于繼彬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省漁業(yè)技術(shù)推廣中心;蘇州先達(dá)基因科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6816
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)草魚(yú)出血病毒的特異性引物對(duì)以及所述的引物對(duì)配合使用的探針。本發(fā)明還公開(kāi)了一種檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明以草魚(yú)出血病毒中保守基因VP7基因?yàn)闄z測(cè)靶點(diǎn)，通過(guò)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，使用特異性的引物和探針組合，提高了草魚(yú)出血病毒I型的檢測(cè)便捷性和特異性，同時(shí)檢測(cè)時(shí)間也大大縮短。與PCR檢測(cè)方法相比，本發(fā)明的方法省去了產(chǎn)物電泳驗(yàn)證過(guò)程，避免了假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。與qPCR相比，本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便易行，也不需要操作復(fù)雜的儀器設(shè)備，節(jié)約了成本，提高了檢測(cè)效率，同時(shí)便于在大范圍內(nèi)推廣使用。與其他恒溫?cái)U(kuò)增方法相比，本發(fā)明的檢測(cè)方法所需時(shí)間更短，檢測(cè)的準(zhǔn)確率更高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及用于檢測(cè)草魚(yú)出血病毒的特異性引物對(duì)、探針、檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

草魚(yú)(Grass Carp)作為我國(guó)最重要的四大淡水養(yǎng)殖魚(yú)類之一，每年都會(huì)出現(xiàn)大面積的出血癥，死亡率高達(dá)80％，研究資料表明草魚(yú)呼腸弧病毒是草魚(yú)病毒性出血癥的主要病原菌。至今為止，對(duì)于此類傳染病的預(yù)防和治療仍舊很困難。1983年從草魚(yú)體內(nèi)首次分離出該病毒，在對(duì)該病毒經(jīng)過(guò)一系列的形態(tài)、生理生化特性的研究，于1991年國(guó)際病毒分類委員會(huì)第五次會(huì)議正式將該病毒命名為草魚(yú)呼腸弧病毒(Grass carp reovirus，GCRV),并將其納入呼腸弧病毒科(Reoviridae)水生呼腸弧病毒屬(Aquareovirus)。到目前為止，已有30多株GCRV被分離鑒定，且它們的生物學(xué)特性不盡相同。而目前發(fā)現(xiàn)的草魚(yú)呼腸弧病毒主要有3基因型：草魚(yú)呼腸弧病毒I型，代表株為873；草魚(yú)呼腸弧病毒II型，代表株為HZ 08和GD 108；草魚(yú)呼腸弧病毒III型，代表株為104。本研究檢測(cè)的是草魚(yú)呼腸弧病毒I型。

目前草魚(yú)呼腸弧病毒檢測(cè)及鑒定的方法有很多，過(guò)去最常用于檢測(cè)草魚(yú)呼腸弧病毒的方法葡萄球菌蛋白A協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)(SPACOA)，該方法快速、特性性強(qiáng)、無(wú)需復(fù)雜及昂貴的設(shè)備，但靈敏度不是太高。此后，出現(xiàn)了酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)來(lái)檢測(cè)草魚(yú)呼腸弧病毒的技術(shù)，ELISA檢測(cè)結(jié)果能夠量化，容易判斷且耗時(shí)短，邵健忠等人建立了Dot-ELISA檢測(cè)GCRV的技術(shù)，該技術(shù)的靈敏度要高于葡萄球菌蛋白A協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)^[2](SPACOA)，但該方法對(duì)酶活性要求也高,依賴酶活性的發(fā)揮，任何影響酶活性的發(fā)揮都有可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，且針對(duì)亞型病毒株存在無(wú)法區(qū)分的問(wèn)題。另外,該類方法所需的試劑盒價(jià)格較昂貴，不利于大面積推廣；隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了靈敏度、準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性更高的PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)。

PCR以4種dNTP為底物，在引物存在的情況下，在DNA模板的3’末端進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸，多次反復(fù)的循環(huán)能使微量的模板核酸得到指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增。由于草魚(yú)呼腸弧病毒是一種RNA病毒，因此RT-PCR檢測(cè)方法尤其適用草魚(yú)呼腸弧病毒的檢測(cè)鑒定。RT-PCR法檢測(cè)草魚(yú)呼腸弧病毒的基本步驟包括樣本的前處理，在RT-PCR總反應(yīng)體系中加入緩沖液、氯化鎂、Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、模板和引物，設(shè)置擴(kuò)增條件擴(kuò)增反應(yīng)。取微量擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用紫外檢測(cè)儀觀察并用凝膠成像系統(tǒng)照相，觀察是否有目的片段出現(xiàn)。PCR產(chǎn)物的分析一般采用瓊脂糖凝膠電泳分析，初步判斷PCR產(chǎn)物片段的大小與預(yù)計(jì)是否一致。王曉豐、郝貴杰、Zhang建立了檢測(cè)草魚(yú)呼腸弧病毒的RT-PCR技術(shù)，令人頭痛的問(wèn)題是普通PCR擴(kuò)增檢測(cè)容易出現(xiàn)氣溶膠污染，使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，逐漸發(fā)展了熒光定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行GCRV檢測(cè)手段，如周勇、殷亮建立了快速檢測(cè)GCRV的熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)。