[發明專利]檢測植物中茉莉酸含量以及茉莉酸和茉莉酸甲酯總含量的酶聯免疫吸附分析方法

在審

• 申請號: 201811066053.8
• 申請日: 2018-09-13
• 公開（公告）號: CN108828219A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 趙林川
• 申請（專利權）人: 蘇州科銘生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）總含量的酶聯免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于該方法包括以下步驟：

步驟一：免疫原和包被抗原的制備；

步驟二：單克隆抗體的制備；

步驟三：建立測定茉莉酸甲酯的酶聯免疫吸附分析方法(ELISA)；

步驟四：ELISA對植物樣品中茉莉酸的含量及茉莉酸和茉莉酸甲酯總含量的測定。

2.根據權利要求1所述的一種檢測植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）總含量的酶聯免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于，所述的免疫原和包被抗原的制備具體步驟為：

由于茉莉酸分子上有羧基，故可通過碳二亞胺法直接將茉莉酸與載體蛋白相連，將茉莉酸（JA），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），二環己基碳二亞胺（DCC）一同溶于二甲基甲酰胺中（DMF），充分活化，低溫離心取上層清液，后將上清緩慢加入到牛血清白蛋白即BSA或卵清白蛋白即OVA中，充分反應后，離心取上層清液，透析，冷凍干燥，保存待用，投料比n(JA)=n(NHS)=n(DCC)，小分子與載體蛋白的比值在20~70，其中，JA-BSA為免疫原，JA-OVA為包被抗原

。

3.茉莉酸（JA）

根據權利要求1所述的一種檢測植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）總含量的酶聯免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于，所述的單克隆抗體的制備具體步驟為：

免疫：第一次免疫，將免疫原溶于生理鹽水中，再與等體積的福氏完全佐劑混合，皮下多點免疫BALB/C小鼠，每只小鼠免疫原劑量在50~100 μg；兩周后第二次免疫，將福氏完全佐劑換成福氏不完全佐劑，其余步驟相同；兩周后第三次免疫，重復第二次免疫操作，后一周，尾部取血ELISA檢測抗血清效價；取血兩周后第四次免疫，重復第三次免疫步驟并取血測效價；取血兩周后最后一次腹腔加強免疫，不加佐劑；

融合：腹腔加強免疫三天后取小鼠脾臟，將脾細胞與骨髓瘤細胞（SP2/0）按5:1~10:1的比例混合，在50%聚乙二醇4000的作用下融合，雜交瘤細胞用HAT培養液混懸，加入預先含有飼養細胞的96孔培養板，置于37℃，5% CO2培養箱中培養；

篩選：融合后2周左右，用間接ELISA法篩選，將陰性孔無色或接近無色，而陽性孔明確顯色的細胞用有限稀釋法進行亞克隆2-3次，及時進行檢測；

單克隆抗體的大量生產：腹腔注射福氏不完全佐劑致敏BALB/C小鼠，7-10天后腹腔接種雜交瘤細胞，觀察小鼠腹水情況，待腹水盡可能多，瀕于死亡之前，收集腹水，多次離心取澄清腹水即作為單克隆抗體，單抗與甘油以及磷酸緩沖溶液（PB）4：5：1混合并置于-20℃保存。

4.根據權利要求1所述的一種檢測植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）總含量的酶聯免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于，所述的建立測定茉莉酸甲酯的酶聯免疫吸附分析方法(ELISA)具體步驟為：

優化多個實驗條件，在最佳條件的基礎上，繪制出標準曲線，結果表明，該單克隆抗體對茉莉酸甲酯（MeJA）的特異性以及靈敏度（IC50）優于對茉莉酸（JA），在此發現上建立了以單克隆抗體為基礎以茉莉酸甲酯（MeJA）為實際檢測對象的酶聯免疫吸附分析方法(ELISA)。

5.根據權利要求1所述的一種檢測植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）總含量的酶聯免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于，所述的ELISA對植物樣品中茉莉酸的含量及茉莉酸和茉莉酸甲酯總含量的測定的具體步驟為：

①樣品提取方法：

本發明根據檢測目標物的不同設計了兩種不同的樣品提取方法，分別用于檢測植物樣品中的茉莉酸含量（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯總含量（JAs），但是最終都是以茉莉酸甲酯（MeJA）的形式作為被檢測對象；

檢測植物中茉莉酸含量（JA）的提取方法，只提取茉莉酸（JA），然后將其甲基化變成茉莉酸甲酯（MeJA）：參考NY/T 2871-2015方法并稍作修改，新鮮植物材料(0.5 g)剪碎后于2mL預冷的80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）中4℃下浸提16小時，（然后加入一定的JA標準溶液，形成一系列加標樣品）離心后，殘渣中再次加入80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）復提2小時，再次離心取上清，合并上清液，用甲酸調節pH至2.5-3.0，后上Sep-Pak C18小柱(Waters, Milford, USA)，上柱前用2mL 20%甲醇水溶液（甲醇-水：20-80，v/v）活化平衡小柱，上樣后按以下步驟：①用2mL 1%甲酸水溶液（1 mL甲酸加水至100 mL）淋洗；②用2mL甲醇淋洗；③用2mL 0.5%氨水甲醇（0.5 mL NH4OH加甲醇至100mL）洗脫兩次，收集洗脫液，洗脫液中加入重氮甲烷將提取物茉莉酸（JA）甲基化10分鐘獲得茉莉酸甲酯（MeJA），然后將其均分成兩部分，分別用于ELISA和HPLC分析，室溫下氮氣吹干，其中一份復溶于0.2mL甲醇，再用PBS稀釋，用于ELISA；另一份用1mL甲醇復溶，直接用于HPLC分析；

檢測植物中茉莉酸和茉莉酸甲酯總含量（JAs）的提取方法，同時提取茉莉酸（JA）和茉莉酸甲酯（MeJA），然后將其中的茉莉酸（JA）甲基化變成茉莉酸甲酯（MeJA）：新鮮植物材料(0.5 g)剪碎后于2mL預冷的80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）中4℃下浸提16小時，離心后，殘渣中再次加入80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）復提2小時，再次離心取上清，合并上清液，提取液中加入重氮甲烷將提取物中的茉莉酸（JA）甲基化10分鐘使得其中茉莉酸和茉莉酸甲酯均以茉莉酸甲酯（MeJA）的形式存在，然后將其均分成兩部分，分別用于ELISA和HPLC分析，室溫下氮氣吹干，其中一份復溶于0.2 mL甲醇，再用PBS稀釋，用于ELISA；另一份用1mL甲醇復溶，直接用于HPLC分析；

HPLC測定條件為：色譜條件: C18 柱 (4.6mm×250mm, 5μm)，流動相為乙腈：0.2%三乙胺水溶液（用磷酸調節pH至4）=60:40 （v/v）；流速為0.8 mL/min；進樣量為10 μL；紫外檢測波長為210nm；柱箱溫度為35℃；在10分鐘左右出峰；

②實際樣品的檢測并與HPLC比較：

選擇了一系列樣品，根據兩種樣品提取方法，分別對植物中茉莉酸含量（JA）和茉莉酸和茉莉酸甲酯總含量（JAs）進行測定，并將ELISA結果與HPLC進行比較；

③加標回收實驗：

為了進一步證明本方法的實用性和準確性，本發明進行了一系列加標實驗，檢測茉莉酸（JA）的加標回收率，加標回收結果與HPLC進行對比。