[發(fā)明專利]一種超低溫脫除建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的方法

有效

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• 申請日: 2018-09-12
• 公開（公告）號(hào): CN109042331B
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王仁睿;李杰
• 申請（專利權(quán)）人: 西南科技大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 北京眾合誠成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

本發(fā)明公開了一種脫除建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的方法，包括以下步驟：以感染建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的蝴蝶蘭組培苗為對(duì)象，在體視顯微鏡下取莖尖；莖尖放入在預(yù)培養(yǎng)基進(jìn)預(yù)培養(yǎng)；用加載液加載莖尖；用冰凍保護(hù)液處理莖尖；將冰凍保護(hù)液處理后的莖尖投入液氮中進(jìn)行超低溫處理；將超低溫處理后的莖尖放入卸載液進(jìn)行卸載；處理完的莖尖放入再生培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)入正常光照下進(jìn)行培養(yǎng)；3個(gè)月后，莖尖順利成苗。本發(fā)明能夠提高莖尖成活率和再生率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于脫毒技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種超低溫脫除建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的方法。

背景技術(shù)

目前已報(bào)道侵染蝴蝶蘭的病毒有25種，其中建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaicvirus,CymMV)和齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossum ringsopot virus,ORSV)發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重。長期的無性繁殖導(dǎo)致蝴蝶蘭體內(nèi)病毒不斷積累，缺乏有效防治兩種病毒的侵染和傳播方法使蝴蝶蘭普遍感染病毒，這已成為影響蝴蝶蘭種苗質(zhì)量的瓶頸問題之一。世界多國包括我國各地均報(bào)道蝴蝶蘭種苗感染兩種病毒的情況及其普遍。建蘭花葉病毒引起蝴蝶蘭葉片和花瓣出現(xiàn)褪綠條紋或壞死斑點(diǎn)，抑制植物生長；齒蘭環(huán)斑病毒引起蝴蝶蘭植物葉片產(chǎn)生黃化條斑或黃綠斑駁的嵌紋、花瓣無法展開或色素不均、局部壞死。兩種病毒常復(fù)合侵染，危害更甚，嚴(yán)重影響蝴蝶蘭的生長狀況，降低其市場價(jià)值。據(jù)報(bào)道，兩種病毒造成的系列影響已對(duì)中國臺(tái)灣省蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)造成重創(chuàng)。國際上已經(jīng)認(rèn)識(shí)到這兩種病毒的危害，多數(shù)國家現(xiàn)已推行了種苗檢疫證書制度，嚴(yán)格規(guī)定進(jìn)口蝴蝶蘭不能攜帶這兩種病毒，這導(dǎo)致了相當(dāng)大數(shù)量的蝴蝶蘭種苗出口受阻。

植株一旦感染病毒則無法根治，因此栽培無毒苗是目前生產(chǎn)上防治病毒的有效方式，生產(chǎn)脫毒苗是目前生產(chǎn)上防治病毒的有效方式，對(duì)蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)至關(guān)重要。建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的脫毒研究目前均采用傳統(tǒng)脫毒方法，其中廣泛采用的方法是化學(xué)藥劑結(jié)合分生組織培養(yǎng)。這種方法存在以下三點(diǎn)弊端：①化學(xué)藥劑對(duì)植物具有毒害作用。研究結(jié)果表明，藥劑濃度較低，處理時(shí)間較短，對(duì)植物毒害作用不大，但病毒脫除效率低；藥劑濃度較高，處理時(shí)間較長，病毒脫毒效率高，但對(duì)植物產(chǎn)生很大的毒害作用甚至引起植物死亡。②化學(xué)藥劑易引起種苗遺傳變異。已有研究表明，在培養(yǎng)基中添加化學(xué)藥劑易引起植物種苗發(fā)生遺傳變異，而現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中又缺乏對(duì)于脫毒苗進(jìn)行相關(guān)的遺傳穩(wěn)定性鑒定，導(dǎo)致脫毒存在很大風(fēng)險(xiǎn)，這對(duì)于產(chǎn)業(yè)來說將造成無可挽回的損失。③分生組織過小極易引起褐化。為了避免藥劑對(duì)植株產(chǎn)生毒害，研究者常降低化學(xué)藥劑的濃度，而剝?nèi)≥^小的分生組織。眾所周知，分生組織的大小與再生率成正相關(guān)，而與脫毒率成負(fù)相關(guān)。對(duì)于蝴蝶蘭而言，面臨所取分生組織過小極易引起褐化的難題，分生組織小于1mm以下褐化率和死亡率均為100％。

超低溫脫毒技術(shù)是在超低溫保存技術(shù)上延伸出來、目前發(fā)展迅猛的一種新型脫毒技術(shù)，指將感染病原體(病毒、植原體、細(xì)菌)的材料經(jīng)液氮短暫處理后脫除病原體。據(jù)國內(nèi)外學(xué)者報(bào)道，超低溫脫毒技術(shù)已在13種植物上有所應(yīng)用，成功脫除了23種病毒、3種植原體和1種細(xì)菌。超低溫脫毒技術(shù)只使用液氮作為處理手段，不使用任何化學(xué)藥劑，避免了對(duì)植物的毒害問題，液氮保存作為一種常規(guī)的種質(zhì)資源保存手段已被證實(shí)再生植株是遺傳穩(wěn)定的，而且與常規(guī)分生組織脫毒不同，超低溫脫毒技術(shù)的脫毒效率與分生組織大小無關(guān)，因此不用取過小的分生組織。

目前超低溫脫毒技術(shù)尚未應(yīng)用于建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒常用脫毒技術(shù)中剝?nèi)∏o尖過小、易褐化、化學(xué)藥劑對(duì)植株有毒害作用和易引起變異等弊端，以安全、有效的超低溫療法為技術(shù)核心，提供了一種脫除建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種脫除建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的方法，包括以下步驟：

步驟1、以感染建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的蝴蝶蘭組培苗為對(duì)象，在超凈工作臺(tái)的條件下，在體視顯微鏡下取1.0-1.5cm大小的莖尖；莖尖放入在預(yù)培養(yǎng)基進(jìn)預(yù)培養(yǎng)；

步驟2、在室溫條件下用加載液加載莖尖；