[發明專利]一種超低溫脫除建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的方法

有效

• 申請號: 201811063504.2
• 申請日: 2018-09-12
• 公開（公告）號: CN109042331B
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發明（設計）人: 王仁睿;李杰
• 申請（專利權）人: 西南科技大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種脫除建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、以感染建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的苗齡為6周的蝴蝶蘭組培苗為對象，在超凈工作臺的條件下，在體視顯微鏡下取1.0-1.5cm大小的莖尖；莖尖放入在預培養基在黑暗條件下進預培養1-3天，所述預培養基為BM培養基+0.6M蔗糖，每升所述的BM培養基包括以下組分：花寶1號3g、乙二胺四乙酸鐵鈉10ml、有機物10ml、蛋白胨1.5g、蔗糖30g、瓊脂7g，pH值為6.0，所述乙二胺四乙酸鐵鈉通過以下方法制備所得：3.67g乙二胺四乙酸鐵鈉溶于1000ml蒸餾水，制備得到乙二胺四乙酸鐵鈉溶液；有機物通過以下方法制備得到：將甘氨酸0.1-0.3g、硫胺素0.8-1.2g、鹽酸吡哆醇0.05-0.15g、泛酸鈣0.05-0.15g、肌醇8-12g混合溶解于1000ml，制備得到有機物；

步驟2、在室溫條件下用加載液加載莖尖，所述加載液為BM+2M甘油+0.4M蔗糖；加載液用量為20-30ml，加載液加載莖尖的時間為20-30分鐘；

步驟3、0℃條件下用PVS2玻璃化溶液處理莖尖，處理時間為40-50分鐘，處理完畢后，用移液槍吸取PVS2溶液在鋁箔紙上制作小滴，再將莖尖逐個放進小滴，用鑷子將攜帶莖尖的鋁箔紙夾住，投入液氮中進行超低溫處理，超低溫處理時間為25-35分鐘，所述PVS2玻璃化溶液為：MS+30％甘油+15％乙二醇+15％DMSO+0.4M蔗糖；所述PVS2玻璃化溶液的用量為20-30ml；

步驟4、夾起超低溫處理后的莖尖，放入卸載液進行卸載；處理完的莖尖放入再生培養基，暗培養7天，再轉入正常光照下進行培養；3個月后，莖尖順利成苗，所述再生培養基為BM+GA₃2.0 mg/L。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4中的卸載液為BM+1.2M蔗糖；卸載時間為25-35min。